Characterization of Amyloid Fibril Networks by Atomic Force Microscopy

Dense networks of amyloid nanofibrils fabricated from common globular proteins adsorbed to solid supports can improve cell adhesion, spreading and differentiation compared to traditional flat, stiff 2D cell culture substrates like Tissue Culture Polystyrene (TCPS). This is due to the fibrous, nanotopographic nature of the amyloid fibril networks and the fact that they closely mimic the mechanical properties and architecture of the extracellular matrix (ECM). However, precise cell responses are strongly dependent on the nanostructure of the network at the cell culture interface, thus accurate characterization of the immobilized network is important. Due to its exquisite lateral resolution and simple sample preparation techniques, Atomic Force Microscopy (AFM) is an ideal technique to characterize the fibril network morphology. Thus, here we describe a detailed protocol, for the characterization of amyloid fibril networks by tapping mode AFM., 与传统的扁平，僵硬的2D细胞培养底物如组织培养聚苯乙烯（TCPS）相比，由普通球形蛋白质吸附至固体支持物制备的淀粉样蛋白纳米原纤维的密集网络可以改善细胞粘附，扩散和分化。 这是由于淀粉样蛋白原纤维网络的纤维性，纳米形貌性质以及它们模仿细胞外基质（ECM）的机械性质和结构的事实。 然而，精确的细胞响应强烈依赖于细胞培养界面处的网络的纳米结构，因此固定网络的准确表征是重要的。 原子力显微镜（AFM）由于其精确的横向分辨率和简单的样品制备技术，是表征原纤维网络形态的理想技术。 因此，在这里我们描述了一个详细的协议，用于表征模式AFM的淀粉样原纤维网络。【背景】吸附到固体载体上的由常见球状蛋白组装的无毒淀粉状蛋白原纤维网络（Jung等人，2011; Lara等人，2011）具有广泛的应用（Dharmadana等人，2017; Wei等人，2017）。特别有意义的是它们在真核细胞培养和一般生物材料中的应用（Reynolds等人，2013,2014和2015; Gilbert等人，2017b）。这主要是由于淀粉样原纤维网络具有与许多细胞类型（ECM）的局部微环境非常相似的形态学和机械性质。这样的淀粉样蛋白原纤维网络具有附加的吸引力，即它们制造简单，价格便宜并且具有可以容易地复制的明确的化学物质。正如所料，生长在这些淀粉样蛋白原纤维网络上的细胞的反应高度依赖于原纤维网络本身的纳米级特性。例如，原纤维直径，纳米级粗糙度，表面覆盖度和原纤维形态的微小变化已经显示出影响细胞附着和扩散（Reynolds等人，2014和2015）。因此，在将其用于细胞培养应用之前，准确地表征固定化网络的纳米形貌和表面粗糙度是重要的。原子力显微镜是一种强大的技术来执行这种分析，因为它只需要很少的样品制备，具有纳米级的横向分辨率和亚纳米级的垂直分辨率（Reynolds等人，2014和2015; Gilbert等人。 ，2017a和2017b; Reynolds ，2017）。另外，诸如纳米粗糙度的参数可以通过后成像分析来提取。在该协议中，我们将描述通过AFM在固体（云母）基底上成像淀粉样蛋白原纤维的稠密网络（由蛋白质鸡蛋白溶菌酶制造）的过程。我们还将描述后处理分析的最常见步骤，即展平（去除样品倾斜和弯曲伪像）和粗糙度分析。