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[高分] 学位论文 梨火疫病菌的分子生物学检测及免疫磁珠分离技术
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贾平乔 • 华东理工大学 • 导师：徐殿胜; 易建平 • 2008年 摘要： 梨火疫病是由Erwinia amylovora引起的极具毁灭性的细菌病害，世界上许多国家和地区(包括我国)将其列为检疫性有害生物。本论文针对进境商用苹果果实中携带梨火疫病菌Erwinia amylovora数量有限的特点，建立了准确灵敏的套式PCR的检测体系；同时以梨火疫病菌Erwinia amylovora菌体全细胞为抗原免疫小鼠，制备了梨火疫病菌的单克隆抗体，利用单抗和免疫磁珠建立了实用、简单的免疫磁珠吸附分离技术。 从源于病菌的pEA29质粒的三对引物P29A/P29B、AJ75/AJ76和PEANT1/PEANT2中筛选灵敏度比较高的引物P29A/P29B和PEANT1/PEANT2配对组合成套式PCR检测方法，其检测灵敏度可达0.15 pg菌体DNA，是常规PCR灵敏度的1000倍，比单管套式PCR的灵敏度高10倍。利用该检测方法、EPPO推荐的单管套式PCR方法以及常规PCR方法对美国、新西兰、日本和智利等国进境的166批苹果样品进行检测，三种检测方法的样品阳性率分别为53.6％，38.0％和8.4％，试验结果表明套式PCR方法可用于进境商用健康无症苹果的梨火疫病菌快速检测。 以梨火疫病菌菌株850菌体全细胞为抗原免疫小鼠，通过多轮细胞筛选，最终得到四株稳定分泌抗体的单克隆细胞株，并制备了四株细胞株的腹水抗体，腹水抗体的间接ELISA效价为32000-64000。利用包被亲和基团的磁珠，通过非特异性吸附包被制备的单抗，进而特异性吸附抗原(目的菌)，建立了简单、实用、有效和灵敏的梨火疫病菌分离方法。 |
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