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烟酰胺单核苷酸的生物合成及代谢改造
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| 其它 | β-烟酰胺单核苷酸 (Nicotinamide mononucleotide, NMN) 是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+) 生物合成的中间产物，NAD+是一种重要的辅酶物质，在细胞代谢和能量代谢过程中发挥着重要作用，同时NAD+是许多生物体中控制衰老过程的关键分子。近年来，NMN因具有抗衰老药物的潜力而引起了极大的关注，研究人员通过基因工程、代谢工程和高通量筛选等方法，对NMN的生物合成途径进行了深入研究。但目前生物合成NMN的产率较低，急需建立完整的NMN生产方法，为实现NMN的工业化生产奠定基础。为了在大肠杆菌中实现NMN高产菌株的构建，本论文主要针对E.coli表达菌株BW25113进行了一系列代谢工程改造，以烟酰胺 (NAM) 和葡萄糖为底物，对NMN的生物合成进行分析。本研究通过整合来自噬几丁质菌 (Chitinophaga pinensis) 的烟酰胺磷酸核糖基转移酶 (CpNampt) 和来自枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 的磷酸核糖焦磷酸合成酶 (BsPRS) ，最终成功在大肠杆菌中构建NMN的合成通路。通过基因工程的手段优化代谢通路，对NMN降解途径的关键基因进行敲除，实现NMN从胞内到胞外的积累，并明显减弱了NMN在胞外的降解速率。为进一步提高胞外NMN的产量，因此，筛选一个高效的NMN转运蛋白十分必要。在本研究中，我们筛选到一个新的NMN外排蛋白BspA，其转运效率达到100%，能将胞内的NMN全部转运到胞外，全细胞催化在摇瓶中NMN含量达3.91 g/L，在2 L发酵罐中含量达16.95 g/L，已接近目前文献报道的最高产量。此外，在NMN 合成过程中，磷酸核糖焦磷酸 (Phosphoribosyl diphosphate, PRPP) 作为另一个重要的中间前体，可由葡萄糖经过磷酸戊糖途径产生。PRPP是重要的代谢中间物参与多种反应，因此其在细胞内的浓度受到严格调控，这也限制了NMN的持续合成。为进一步构建NMN高产菌株，解决PRPP不足的问题，增强PRPP的供给，我们尝试在大肠杆菌中额外引入木糖代谢途径。在以葡萄糖和木糖为混合碳源的培养基中，添加底物烟酰胺 (NAM) ，能持续合成NMN，在2 L发酵罐上NMN产量为29.0 g/L，远超目前已报道的最高产量。本研究 |
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