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Molecular Basis for a Toluene Monooxygenase to Govern Substrate Selectivity

甲苯 羟基化 单加氧酶 对映体药物 热稳定性 化学 催化作用 生物催化 立体化学 饱和突变 组合化学 有机化学 生物化学 对映选择合成 反应机理 突变体 细胞色素P450 基因
作者
Chun‐Chi Chen,Meng Dai,Lilan Zhang,Jing Zhao,Wei Zeng,Min Shi,Jian‐Wen Huang,Weidong Liu,Rey‐Ting Guo,Aitao Li
出处
期刊:ACS Catalysis [American Chemical Society]
卷期号:12 (5): 2831-2839 被引量:23
标识
DOI:10.1021/acscatal.1c05845
摘要

Class I P450 monooxygenase from Rhodococcus coprophilus TC-2, termed P450tol, is the only naturally evolved toluene hydroxylating enzyme known to hydroxylate toluene to produce benzyl alcohol. To investigate its mechanism of action, we solved the unique crystal structures of P450tol and its complex with the substrate. The complex structure indicates that P450tol restricts the toluene binding position with several hydrophobic residues, such that the hydroxylation could take place precisely on the benzylic site. Notably, we found additional space in the toluene-binding pocket and thus examined P450tol activity toward larger substrates. As a result, several halogenated toluenes can also be hydroxylated by P450tol on the benzylic site. We also conducted site saturation mutagenesis (SSM) to enable subterminal or benzylic hydroxylation of propylbenzene. The resulting enantiopure alcohols are essential intermediates for the synthesis of important pharmaceuticals. To facilitate further applications, we fused P450tol and reductase domain derived from self-sufficient P450s. The chimeric enzymes containing the CYP116B46 reductase domain from thermophilic Tepidiphilus thermophiles (P450tol-CYP116B46) exhibit higher thermostability and catalytic activity than the one containing RhFRED reductase domain from mesophilic Rhodococcus sp. strain NCIMB 9784. In conclusion, we manifested the origin of regioselectivity of P450tol-catalyzed benzylic hydroxylation and explored the versatility in substrate utilization of P450tol. Furthermore, the self-sufficient chimeric enzyme with high catalytic activity and stability was generated. We are convinced that these results highlight the great potentials of P450tol in biotechnological and pharmaceutical applications.
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