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Method for rapid optimization of recombinant GPCR protein expression and stability using virus-like particles

G蛋白偶联受体 重组DNA HEK 293细胞 表面等离子共振 配体结合分析 蛋白质工程 计算生物学 化学 生物化学 转染 兴奋剂 生物 受体 分子生物学 纳米技术 基因 纳米颗粒 材料科学
作者
Thao T. Ho,Jasmine Nguyen,Juping Liu,Paweł Stańczak,Allison Thompson,Yingzhuo Yan,Jasmine Chen,C.K. Allerston,Charles L. Dillard,Xu Hu,Nicholas J. Shoger,Jill S. Cameron,Mark E. Massari,K. Aertgeerts
出处
期刊:Protein Expression and Purification [Elsevier]
卷期号:133: 41-49 被引量:8
标识
DOI:10.1016/j.pep.2017.03.002
摘要

Recent innovative approaches to stabilize and crystallize GPCRs have resulted in an unprecedented breakthrough in GPCR crystal structures as well as application of the purified receptor protein in biophysical and biochemical ligand binding assays. However, the protein optimization process to enable these technologies is lengthy and requires iterative overexpression, solubilization, purification and functional analysis of tens to hundreds of protein variants. Here, we report a new and versatile method to screen in parallel hundreds of GPCR variants in HEK293 produced virus-like particles (VLPs) for protein yield, stability, functionality and ligand binding. This approach reduces the time and resources during GPCR construct optimization by eliminating lengthy protein solubilization and purification steps and by its adaptability to many binding assay formats (label or label-free detection). We exemplified the robustness of our VLP method by screening 210 GALR3-VLP variants in a radiometric agonist-based binding assay and a subset of 88 variants in a label-free antagonist-based assay. The resulting GALR3 agonist or antagonist stabilizing variants were then further used for recombinant protein expression in transfected insect cells. The final purified protein variants were successfully immobilized on a biosensor chip and used in a surface plasmon resonance binding assay.
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