Transgene expression and plant regeneration in the Brassicaceae Aethionema arabicum

Transformation, der Einbau zusatzlicher DNA Abschnitte, ist eines der wichtigsten Werkzeuge in der modernen Molekularbiologie and Genetik, um Pflanzengenome modifizieren und folglich die Funktion und Regulation ausgewahlter Gene studieren zu konnen. Verschiedene Techniken wurden entwickelt, mit denen unzahlige Pflanzenarten fur die Grundlagenforschung, aber auch fur die moderne Landwirtschaft, transformiert werden konnten. Die annuelle Pflanze Aethionema arabicum, wie die Modellpflanze Arabidopsis thaliana eine Vertreterin der Familie der Brassicaceae, bildet zwei verschiedene Frucht- und Samentypen auf demselben Individuum aus; bekannt als Heterokarpie. Um die zugrundeliegenden molekularen Zusammenhange dieser Heteromorphie in Verbindung mit der Anpassung an stark schwankende Umweltbedingungen verstehen zu konnen, stellt die Transformation ein wichtiges Werkzeug dar, diese molekularen Prozesse zu studieren. Im Zuge dieser Arbeit wurden verschiedene Methoden angewendet, die bereits in anderen Pflanzenarten zu einer erfolgreichen Tranformation gefuhrt haben. Grundsatzlich kann zwischen einer Agrobacterium-vermittelten Transformation und einer biolistischen Transformation unterschieden werden, um Fremd-DNA in das Pflanzengenom zu integrieren. Das fur A. thaliana entwickelte Protokoll der „Floral Dip“ Methode wurde fur Aethionema mit einem Markergen getestet, welches GFP direkt im Samen exprimieren sollte. Aufgrund hoher Autofluoreszenz der Samen im GFP Absorptionsspektrum war dieser Ansatz nicht erfolgreich. Jedoch konnte eine transiente GFP Expression in einzelnen Zellen des jeweiligen Gewebeverbands mit zwei anderen Methoden erreicht werden: zum einen durch eine Agrobacterium-Infiltration von Blattgewebe (leaf infiltration) und zum anderen uber einen biolistischen Ansatz, indem Plasmid-DNA verbunden mit Goldpartikeln auf Hypokotylgewebe von Keimlingen geschossen wurde (particle bombardment). Die Expression hielt in der Regel einige Tage an, und der Wirkungsgrad war vom verwendeten Konstrukt sowie vom Agrobacterium Stamm abhangig. Virus-induced gene silencing (VIGS) ist ein System, um gezielt Transkripte in Zellen herunterzuregulieren. Das verwendete Tobacco Rattle Virus (TRV) mit einem eingebauten Phytoenedesaturase Insert bewirkt eine Ausbleichung der Blatter in Nicotiana benthamiana. Diese Kombination wurde in dieser Arbeit erfolgreich als Kontrolle verwendet. Fur Ae. arabicum konnte ein solcher Bleichungseffekt nicht nachgewiesen werden, jedoch wurde in einem der beiden Okotypen eine veranderte Morphologie des Hauptsprosses beobachtet, wenn das Gen Indehiscent (IND) als potentielles Target fur die Inaktivierung bereitgestellt wurde. Die Prasenz der viralen RNA in der Pflanze sowie die Reduktion des IND Transkripts bleiben zu bestatigen, bevor Schlussfolgerungen gezogen werden konnen. Der vielversprechendste Ansatz jedoch scheint uber eine Gewebekultur von jungem Hypokotylgewebe zu funktionieren. Mittels einer Co-Kultivierung mit Agrobacterium wurde eine Expression von diversen Markergenen in induziertem Kallus erreicht, welche uber Monate hinweg beibehalten werden konnte. Zusatzlich wuchs der Kallus auf einem Hygromycinmedium, was die Expression des entsprechenden Resistenzgens vermuten lies. Eine stabile Integration in das Pflanzengenom muss jedoch erst mit einem Southern Blot bestatigt werden. Auserdem muss ein Regenerationsprotokoll entwickelt werden, um aus dem Kallus schlieslich fruchtbare Pflanzen zu erhalten. Nichtsdestoweniger konnten in einer in vitro Kultur mit entsprechend hohen Mengen des Pflanzenhormons Zytokinin Sprosse aus Blattschnitten generiert werden. Die Etablierung von moglichen Markergenen und Konstrukten sowie Protokolle fur die transiente Expression nach Co-Kultivierung mit Agrobacterium und fur die Regeneration von Sprossen aus Blattschnitten bilden eine vielversprechende Basis, diese Ansatze zu verbinden, stellen wichtige Schritte auf dem Weg zu transgenen Aethionema Pflanzen dar.