非洲猪瘟病毒微滴数字PCR (ddPCR)方法的建立及应用

目的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)能导致猪群高死亡率，从而造成严重的经济损失。因此，建立严密、高效的防控系统，包括灵敏、准确的诊断方法以及高效的预报预警机制等，以避免ASF传入我国。本文旨在建立一种新型而高灵敏度的ASFV微滴数字PCR (Droplet digital PCR，ddPCR)检测方法。 方法针对ASFV K205R基因设计一对特异性引物和TaqMan探针，通过反应条件优化，建立了ASFV实时荧光定量PCR (qPCR)和ddPCR检测方法；并对两种方法的线性关系、灵敏性、特异性和重复性进行了评估，利用建立的ASFV检测方法对163份国内和进境的组织样本及血清样本进行检测，血清样本经商品化ASFV ELISA试剂盒复检，评估不同方法检测结果的符合率。 结果建立的ASFV qPCR和ddPCR检测方法线性关系较好(R2≥0.998)，ddPCR的最低检测限度可达到0.36拷贝，在20 μL反应体系中约为10拷贝/反应，检测灵敏度是qPCR的10倍。ASFV ddPCR检测方法具有很高的特异性和重复性，不与其他猪常见病毒发生交叉反应。 结论该方法灵敏度高、特异性强，可作为一种有效的分子生物学方法来诊断ASFV，为防止该病传入我国以及ASFV的实时监测提供新的技术储备，同时促进ddPCR技术在我国的发展和应用。