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Fluorogenic oligonucleotide cleavage probes with a branched linker improve RNA detection

生物 寡核苷酸 连接器 劈理(地质) 核糖核酸 计算生物学 分子探针 DNA 核酸 分子生物学 组合化学 遗传学 基因 操作系统 古生物学 断裂(地质) 化学 计算机科学
作者
Bruktawit Maru,Ayodele Edinboro,Adam Katolik,Roberto El-Khoury,Kaleena Basran,Alexander S. Wahba,Masad J. Damha,Nathan W. Luedtke,Maureen McKeague
出处
期刊:Nucleic Acids Research [Oxford University Press]
卷期号:53 (5)
标识
DOI:10.1093/nar/gkaf141
摘要

Fluorescent probe-based quantitative polymerase chain reaction (qPCR) is essential for DNA/RNA quantification widely used in research and clinical diagnostics. The performance of fluorogenic probes depends heavily on their design, particularly the identities of the fluorophore and quencher moieties, and the linkers used to attach them to oligonucleotides. Here we report a highly modular, three-way branched glycerol 'X' linker in fluorogenic TaqMan® type oligonucleotide probes for multiplexed, reverse transcription qPCR (RT-qPCR). The flexible 'X' linker served as an internal attachment point for various quenchers (BHQ1, BHQ2) in probes containing a variable fluorophore at the 5' end (Flu, Hex, Cy5, Cy5.5). A four-color RT-qPCR 'tetraplex' assay was thereby developed for distinguishing between RNA genomes from SARS-CoV-2, influenza A, and influenza B viruses in a single reaction. The 'X' linker exhibited superior performance with single-molecule detection limits approaching four copies, compared to an internal arabinoside-based (ara) linker strategy, demonstrating the presence of competing processes during primer extension, one where Taq exonuclease activity cleaves the fluorogenic X probe leading to productive fluorescence, and the second where the ara probe is displaced from the PCR template without cleavage. Together these results demonstrate the importance of linker structure selection in oligonucleotides for developing highly effective fluorogenic probes for qPCR.
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