Charakterisierung und Strukturaufklärung des Chromophors im m‐Hydroxybiphenyl‐ Assay zur Bestimmun von Uronsäuren

Photometrische Nachweis‐ und Quantifizierungsmethoden sind in der Kohlenhydratanalytik weit verbreitet. Zu den etablierten Verfahren zählen die Phenol‐Schwefelsäure‐Methode zur Bestimmung des Gesamtkohlenhydratgehalts sowie der m ‐Hydroxybiphenyl ( m ‐HB)‐Assay und dessen Modifikationen zur Quantifizierung von Uronsäuren [1,2]. Diese Methoden beruhen auf dem Erhitzen der kohlenhydrathaltigen Probe in konzentrierter Schwefelsäure, wobei unter Zusatz eines phenolischen Reagenzes farbige Verbindungen entstehen. Ein detailliertes Verständnis der bei der Analyse gebildeten Chromophore ist für eine fundierte Interpretation der Ergebnisse und eine gezielte Optimierung der Methoden unverzichtbar. Die vorliegenden Untersuchungen befassen sich ausschließlich mit der Strukturaufklärung des Chromophors aus dem m ‐HB‐Assay. Während des Erhitzens in konzentrierter Schwefelsäure werden Zucker zu Furanderivaten abgebaut. Im Fall von Uronsäuren konnte hierbei vorwiegend 5‐Formyl‐2‐Furancarbonsäure (5FFA) als Abbauprodukt identifiziert werden. Die Ausbildung des für die quantitative Analyse relevanten Chromophors beruht auf einer säurekatalysierten Reaktion von m ‐HB mit 5FFA, die über eine farblose Triarylmethan‐Zwischenstufe verläuft. Diese Zwischenstufe konnte aus verdünnter Säure isoliert und vollständig charakterisiert werden. Unter Zusatz konzentrierter Säure wurde die Ausbildung des Chromophors bestätigt, eine detaillierte Strukturcharakterisierung war jedoch nicht möglich. Zur Isolierung eines stabileren Chromophors und zur Vermeidung unerwünschter Nebenreaktionen, wie einer Ringöffnung der Furanstruktur, wurde 4‐Carboxy‐benzaldehyd eingesetzt. Hier konnte mittels massenspektrometrischer und NMR‐spektroskopischer Verfahren eine zwitterionische xanthenbasierte Struktur charakterisiert werden. Diese planare Struktur entsteht durch die intramolekulare Bildung eines Ethers sowie durch Oxidation des zentralen Kohlenstoffatoms aus der Triarylmethan‐Zwischenstufe. Mithilfe quantenchemischer Berechnungen konnte diese charakterisierte Struktur erfolgreich auf das ursprüngliche System aus m ‐HB und 5FFA übertragen werden.