扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）代谢工程的研究

扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera），又称扣囊拟内孢霉（Endomycopsis fibuligera），能够表达生淀粉液化酶和糖化酶，被认为是产生淀粉分解酶类的最好的子囊酵母菌之一。 工业生物技术克服了传统的化学加工方式所造成的能源和环境危机，正日益引起人们的重视。淀粉是工业生物技术的主要原料，其来源丰富、价格低廉，是可再生的天然资源。利用扣囊复膜酵母进行生物发酵，直接将淀粉加工成人们所需要的各种产品而无需液化、糖化，可节约能源、降低成本，将具有深远的意义。而且，扣囊复膜酵母较传统的酿酒酵母来说，具有更丰富的次生代谢。 为了便于在细胞中进行分子定向操作，首先应建立一套完整的遗传转化系统。我们在通过功能互补、简并PCR和染色体步行等方法从扣囊复膜酵母中分别克隆到了构建遗传转化系统所必须的ARS序列、可选择性标记基因、诱导型和组成型启动子等元件的基础上，以大肠杆菌质粒pBluescript II SK(-)为骨架、甲醛抗性基因为选择性标记初步建立了扣囊复膜酵母自主复制型质粒为载体的遗传转化系统。同时构建了以甲醛抗性基因为标记的URA3基因中断盒作为线性DNA片断对扣囊复膜酵母PD70进行转化。转化实验结果表明电穿孔转化法比较适合于环形质粒的转化，而原生质体转化法比较适合于线性片断的转化。 本实验室从11个属的132株酵母菌中筛选到一株高产丙酮酸的野生型扣囊复膜酵母菌株PD70。该菌可在不添加氨基酸和维生素的简单培养基上发酵生产丙酮酸。针对PD70在丙酮酸发酵过程中主要副产物为乙醇和甘油这一事实，我们从扣囊复膜酵母中克隆了这两大副产物生物合成途径中的关键酶基因，试图通过基因敲除等手段减少或者阻断副产物的形成，从而促进丙酮酸的积累。对乙醇生物合成途径中的关键酶丙酮酸脱羧酶（PDC）基因进行克隆，结果得到了一个结构基因SfPDC1。该基因包含一个无内含子的长为1740bp的开放阅读框架（ORF）,编码一个579个氨基酸的多肽，具有酵母PDC所具有的功能保守区。对甘油生物合成途径中的关键酶甘油－3－磷酸脱氢酶（GPD）基因进行克隆，结果得到了两个在编码区具有高度序列相似性、而非编码区没有明显同源性的同工酶基因：SfGPD1和SfGPD2。Northern杂交分析表明，在细胞遭受渗透胁迫时，SfGPD1在转录水平上被强烈诱导，同时在细胞内检测到甘油的大量积累。表明SfGPD1参与了渗透胁迫下