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猪流感病毒NP蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
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摘要：【目的】通过猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）NP蛋白的原核表达，建立SIV间接ELISA抗体检测方法，为SIV血清学调查提供检测手段。【方法】设计1对SIV NP基因的特异性引物，以pMD19-T-NP重组质粒为模板，通过PCR扩增获得目的基因片段，随后克隆至pET-32a（＋）原核表达载体，构建pET32a-SIV-NP重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞诱导表达并优化条件。利用His标签镍柱纯化重组NP蛋白作为包被抗原，通过单一变量法优化间接ELISA条件，包括抗原包被浓度、血清稀释度、二抗稀释度及一抗、二抗孵育时间，确定间接ELISA方法的阴阳性临界值，检验其特异性、灵敏性、重复性及与血凝抑制试验（HI）的符合率，并对2022－2024年不同猪场且不同猪群的623份血清样本进行检测。【结果】试验成功构建pET32a-SIV-NP重组表达载体，实现NP蛋白的原核表达，蛋白分子质量大小约75 ku，具有良好的反应原性。对间接ELISA方法条件进行优化，确定NP包被抗原最佳浓度为1.25 μg/mL，阳性血清稀释度为1∶100，血清样品和二抗孵育时间分别为30、45 min，TMB反应时间为10 min。阴阳性临界值测定结果显示，D450 nm值≥0.435为阳性，D450 nm＜0.349为阴性，介于二者之间为可疑。建立的间接ELISA方法与猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪轮状病毒（PoRV）、猪瘟病毒（CSFV）等病毒标准阳性血清均无交叉反应，特异性好。该方法最低可检测到以1∶3 200稀释的SIV阳性血清，灵敏度高。批内和批间重复试验变异系数均＜10%， 重复性好。HI试验的阳性检出率为43.51%，而所建立的间接ELISA的阳性检出率达53.25%，两种检测方法的符合率为90.26%。间接ELISA方法检测临床623份猪血清样品结果显示，样品总阳性率为37.88%。【结论】本研究成功构建了一种基于SIV NP蛋白的间接ELISA检测体系，为流感病毒的监测提供了可靠的技术支撑。 关键词： 猪流感病毒(SIV);NP蛋白;原核表达;间接ELISA; |
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(2025-6-4)
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