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[高分] 学位论文 BRSV G蛋白单克隆抗体的制备及其DAS-ELISA方法的建立
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摘要：为建立检测牛呼吸道合胞体病毒DAS-ELISA方法,根据BRSV外膜糖蛋白G保守基因设计引物,构建重组克隆载体和重组表达载体,转化至BL21(DE3)感受态细胞中进行表达,应用纯化的G蛋白作为抗原分别免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠制备抗G蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体,利用单克隆抗体的高特异性及双抗体夹心的灵敏性建立检测BRSV的DAS-ELISA方法。G目的基因同GenbankTM(U24713)上发表的牛呼吸道合胞体病毒G基因核苷酸序列同源性为99.83%,氨基酸同源性为99.48%,目的蛋白为可溶性蛋白,大小为36 kDa,表达的G蛋白与BRSV抗体能很好地结合,具有良好的反应原性。重组BRSV-G/E.coli在IPTG最佳诱导浓度为1 mM且诱导5 h时目的蛋白表达量最高,洗脱液中咪唑浓度为200 mM时纯化效率最高,纯化后蛋白浓度为1.5 mg/mL左右。免疫动物后,获得了兔高免血清和5株能够稳定分泌抗G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1E3、2B4、3F6、4B8、5F7,抗体亚类均为IgG1型,轻链均为κ链,杂交瘤细胞培养上清抗体效价分别为1∶2560、1∶640、1∶12800、1∶320、1∶640,腹水效价分别为1∶256000、1∶128000、1∶128000、1∶64000、1∶128000,以抗体效价较高且稳定性最好的1E3作为捕获抗体,多克隆抗体为检测抗体,方阵滴定试验确定捕获抗体1E3最佳工作浓度为2.5μg/mL,多克隆抗体最佳工作浓度为5μg/mL,并对其他反应条件作了进一步的优化,阴阳性临界值为0.239,批内和批间变异系数均小于10%,检测下限为1.43μg/mL,用建立的DAS-ELISA检测方法分别检测常引起牛呼吸道疾病的几种病原,只有牛呼吸道合胞体病毒发生特异性反应。DAS-ELISA和RT-PCR方法同时检测45份样品,敏感性、特异性、符合率分别92.0%、100%、95.6%。结果表明建立的DAS-ELISA检测方法快速、灵敏度高、特异性强,适用于临床样品大规模的检测,为BRSV疫情的监测和快速诊断奠定了基础。 还原 关键词： 牛呼吸道合胞体病毒;G蛋白;多克隆抗体;单克隆抗体;双抗体夹心ELISA; |
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