Beyond ABE fermentation : metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum for the production of alternative metabolites

Au-delà de la fermentation ABE : ingénierie métabolique de Clostridium acetobutylicum pour la production de métabolites alternatifs Clostridium acetobutylicum est utilisé en biotechnologie industrielle depuis un siècle grâce sa capacité à produire de l'acétone et du butanol à partir de nombreux carbohydrates. Notre équipe a récemment démontré que des modifications spécifiques du génome de C. acetobutylicum lui permettent de dégrader efficacement des substrats lignocellulosiques, ce qui en fait un candidat prometteur de bioprocédé consolidé. Cette thèse décrit des stratégies d'ingénierie métabolique pour obtenir des mutants de C. acetobutylicum produisant des produits d'intérêt industriel.Tout d'abord, un outil CRISPR/Cas9 a été utilisé pour supprimer les gènes ptb-buk, ldhA et thlA, afin d'obtenir un mutant dont tous les éléments clés pour l'oxydation du NAD(P)H sont codés par le mégaplasmide pSOL1. Cette souche plateforme a ensuite été utilisée pour insérer les voies NADH-dépendantes de composés que C. acetobutylicum ne produit normalement qu'en petites quantités.L'insertion d'un plasmide codant pour ldhA dans cette souche plateforme, suivie de la perte de pSOL1, a donné un mutant ∆ptb-buk, ∆ldhA, ∆thlA, ∆pSOL1, pforGly441Leu produisant uniquement du lactate à partir du glucose. Cette souche homolactique a ensuite été modifiée en inactivant les gènes hydA et pta codant respectivement pour l'hydrogénase principale et la phosphotransacétylase. Le séquençage génomique complet du mutant a confirmé que l'inactivation de certains gènes clés du métabolisme central suffit à convertir le conventionnel métabolisme biphasique de C. acetobutylicum en un métabolisme homofermentaire.La souche plateforme a ensuite été utilisée pour sélectionner une mutation clé améliorant considérablement la production de X de C. acetobutylicum. Nous avons démontré que la surexpression des gènes CACxxxx et CACxxxx permet à Escherichia coli et C. acetobutylicum de produire du X. Un mutant ∆ptb-buk, ∆ldhA, ∆thlA, ∆pSOL1 avec la région CACxxxx-CACxxxx dupliquée a pu produire 28 g/L de X et 16 g/L d'acétate à partir de 60 g/L de glucose en trois jours, représentant les meilleurs rendement, productivité et titre obtenus pour un procédé anaérobie. Ensuite, la réinsertion d'une voie acétone (thlA3 de Clostridium kluyveri, ctfAB-adc de Clostridium beijerinckii) à la place de hbd a permis une conversion partielle de l'acétate en acétone. De plus, la transformation d'un plasmide codant pour la voie du X au Y de Z a permis la production d'un mélange d'acétate, de X et de Y à partir de glucose. À notre connaissance, il s'agit du seul exemple de production anaérobie de Y à partir de glucose. L’amélioration des voies de l'acétone et/ou du Y permettrait d’obtenir des souches industriellement pertinentes.Enfin, C. acetobutylicum a été modifié pour améliorer les voies de l'éthanol et de deux acides aminés. La transformation d'un plasmide codant pour une pyruvate décarboxylase et une alcool déshydrogénase dans la souche plateforme ∆ptb-buk, ∆ldhA, ∆thlA a augmenté le rendement en éthanol jusqu'à 80% de la valeur théorique, ouvrant la voie à l'ingénierie d'une souche capable de produire uniquement de l'éthanol. La transformation d'un plasmide exprimant le gène d’une acide aminé déshydrogénase et le gène d'un exporteur d'acide aminé dans la même souche plateforme a permis de produire jusqu'à 7 g/L d’acide aminé avec un rendement de 0,5 g/g.