Molecular and biochemical studies of fragrance biosynthesis in rose

Etude de gènes impliqués dans la biosynthèse du parfum chez la rose, Rosa x hybrida La rose est l'une des plantes ornementales les plus populaires, dont les composés volatils sont non seulement impliqués dans les interactions des fleurs avec l’environnement au sens large, mais aussi largement utilisés dans l’industrie des arômes et parfums. Le chapitre 1 décrit l'histoire de la culture de la rose, les usages de son parfum, les connaissances actuelles sur la biosynthèse des composés de ce parfum, ainsi que les voies de biosynthèse des composés volatils qui ont été récemment élucidées chez différentes plantes. Les chapitres expérimentaux 2 et 3 analysent les fonctions de deux gènes exprimés dans les pétales de rose. Ils codent pour des protéines Nudix hydrolase 1 (NUDX1). Le gène NUDX1-1 (nommé RhNUDX1 dans la publication) a été découvert en comparant les transcriptomes de deux cultivars de rose, Rosa x hybrida cv. 'Papa Meilland' (PM) très parfumé et R. x hybrida cv. 'Rouge Meilland' (RM), dépourvu de parfum. Le gène RhNUDX1-1 n'est exprimé que chez PM et son expression est corrélée avec la production de monoterpènes dans les pétales, en particulier de géraniol. Lors de l'étude d'une descendance issue du croisement de R. chinensis cv. ‘Old Blush’ (OB) et de R. x wichurana (Rw), le gène orthologue RcNUDX1-1a, présentant la même fonction, a été caractérisé chez OB. Un gène paralogue, RwNUDX1-2, a été découvert chez Rw et il a été démontré que son expression présentait une corrélation avec la production sesquiterpènes, en particulier de E,E-farnesol. Une série d'analyses in vitro et in vivo ainsi qu'une analyse de corrélation ont permis de vérifier la fonction de RhNUDX1-1, qui hydrolyse le géranyl diphosphate (GPP) en géranyl monophosphate (GP). Une phosphatase non identifiée pourrait catalyser la transformation du GP en géraniol. Des expériences de fusion avec la Green Fluorescent Protein (GFP), suivies de transformation transitoire de feuilles de tabac, ont révélé que RhNUDX1-1 était localisée dans le cytoplasme. Les mêmes approches (analyses QTL, essais enzymatiques et expression transitoire) ont également été appliquées à RwNUDX1-2, démontrant sa fonction dans la production de E,E-farnesol. La cartographie de RwNUDX1-2 et la localisation subcellulaire de la protéine sont encore à l'étude. De plus, la cristallographie des protéines et la modélisation ont été employées pour étudier le mécanisme de l'interaction NUDX1-substrat et les acides aminés potentiellement importants pour la reconnaissance du substrat. Collectivement, ces données révèlent une voie alternative pour la biosynthèse des terpènes, en particulier le géraniol et E,E-farnesol, via l'hydrolyse des prényl diphosphates par les enzymes NUDX1. Nos résultats montrent que la production de composés volatils dans les pétales est fortement corrélée avec l’expression des gènes des voies de biosynthèse. Par conséquent, la régulation transcriptionnelle de RcNUDX1-1a et RwNUDX1-2 joue probablement un rôle important dans la production de parfum. Les promoteurs de RcNUDX1-1a, RcNUDX1-1b, et RwNUDX1-2 et deux facteurs de transcription (FT), RcbHLH79 (OB TF) et RwbHLH79 (Rw TF) ont ainsi été isolés et testés (Chapitre 4). Les FT candidats ont été choisis lors d’une analyse RNA-Seq (Chapitre 5). En utilisant des tests d'expression transitoire avec le gène rapporteur GUS (β-glucuronidase) dans les pétales de rose, il a été montré que les trois promoteurs pouvaient entraîner l'expression de GUS. Les deux FT ont ensuite été introduits dans des feuilles de tabac avec les promoteurs testés, pour voir s'ils étaient capables d'activer ces promoteurs. Aucune transactivation significative n'a été détectée, même si Rw TF semblait pouvoir activer une construction témoin (promoteur du gène de la tomate TPS5. Les transcriptomes de quatre cultivars de rose, dont deux produisent du géraniol mais pas de E,E-farnesol et deux autres produisent du E,E-farnesol mais pas de géraniol, ont été analysés (Chapitre 5) et ont abouti à une liste de FT putatifs pour une étude plus approfondie