Mechanisms of hemolysin A Type 1 secretion in Escherichia coli

Eine der essentiellen Nanomaschinerien in Gram-negativen Bakterien sind die Typ I Sekretionssysteme (T1SS). Sie sekretieren ein breites Spektrum an Substraten aus dem Cytoplasma, uber die innere und ausere Membran, direkt in den extrazellularen Raum. Der Transportprozess erfolgt ungefalten und in einen Schritt ohne ein periplasmatisches Intermediat. Die Vielfalt der sekretierten Proteine reicht von 78 bis 8682 Aminosauren in der Grose und umfasst Hamophore, Lipasen, Hullproteine, Nodulations- und Adhasionsproteine sowie Toxine. Allen Substraten gemein ist das C-terminale Sekretionssignal, welches weder wahrend noch nach der Sekretion abgeschnitten wird. Eines der am besten charakterisierten T1SS Substrate ist das Zellen-lysierende Toxin Hamolysin A (HlyA). HlyA gehort zu der repeats in toxin (RTX) Proteinfamilie. Sein Sekretionssystem besteht aus dem auseren Membranprotein (OMP) TolC, das eine Pore durch die ausere Membran bildet, dem ABC-Transporter Hamolysin B (HlyB) in der inneren Membran, der den Transportprozess antreibt und das Substrat erkennt, und dem Membranfusionsprotein (MFP) Hamolysin D (HlyD), das TolC und HlyB miteinander verbindet und den periplasmatischen Raum uberbruckt. Zusammen bilden diese Proteine das HlyA T1SS. Wahrend dieser Doktorarbeit wurde die Direktionalitat und die Rolle des Sekretionssignals des HlyA Transportes charakterisiert. Die Fusion des gesteigerten grun fluoreszierenden Proteins (eGFP) an den N-Terminus von HlyA bzw. HlyAc (C-terminale 218 Aminosauren von HlyA) resultierte in einer Verstopfung des gesamten HlyA T1SS. Markierungen der Termini und Fluoreszenzmikroskopie bestatigten, dass der C-Terminus als erstes an die Zelloberflache gelangt. Ferner legten Deletionen des Sekretionssignals nahe, dass das Sekretionssignal essentiell fur die Einfuhrung des Substrates in den Translokator ist. Auserdem erlaubten die verstopfen und markierten Transporter die Quantifizierung der aktiven HlyA T1SS pro Bakterienzelle. Dadurch konnte die Sekretionsrate bezogen auf sekretierte Aminosauren pro Sekunde und Sekretionssystem quantifiziert werden. Die Sekretionsrate ist nicht beeinflusst von der Proteinlange, der Anzahl an Glycin-reichen Wiederholungen und der extrazellularen Kalziumkonzentration. Zusatzlich konnten HlyB Mutanten und die Fusionsproteine zeigen, dass die ATP-Hydrolyse essential fur das Einfadeln des Substrates in das HlyA T1SS ist.