Μελέτη μηχανισμών καρδιοπαθειών χρησιμοποιώντας το Zebrafish ως πειραματικό μοντέλο

Οι καρδιαγγειακές παθήσεις αποτελούν στην εποχή μας μία από τις πρώτες αιτίες θανάτου στον ανεπτυγμένο κόσμο. Επίσης, πολύ σημαντική είναι η συμβολή της αγγειογένεσης στην ανάπτυξη των καρκινικών όγκων. Καθίσταται λοιπόν αναγκαία η συμβολή της βασικής έρευνας ώστε να μελετηθούν καλύτερα οι μηχανισμοί των παθήσεων αυτών αλλά και να ανακαλυφθούν νέα φάρμακα που σχετίζονται με την αγγειογένεση. Τα τελευταία χρόνια σημαντικό ρόλο παίζει προς αυτές τις κατευθύνσεις το ζωϊκό πρότυπο μοντέλο zebrafish. Το zebrafish (Danio rerio) χρησιμοποιείται ευρέως ως ζωικό μοντέλο για την κατανόηση της παθοφυσιολογίας των καρδιαγγειακών παθήσεων. Στην παρούσα διατριβή παρουσιάζεται ο καρδιακός φαινότυπος υποτροφικού κόλπου, myh6-/-, σε ενήλικα ψάρια, τα οποία φέρουν μετάλλαξη στη βαριά αλυσίδα κολπικής μυοσίνης του zebrafish. Οι ομόζυγοι φορείς επιβιώνουν μέχρι την ενηλικίωση και είναι γόνιμοι. Στα ενήλικα μεταλλαγμένα ψάρια, ο κόλπος παραμένει υποπλαστικός και εμφανίζει εναπόθεση ελαστίνης, ενώ οι κοιλίες παρουσιάζουν αυξημένο μέγεθος. Στα θηλαστικά, η υπερτροφία είναι ο συνηθέστερος μηχανισμός που οδηγεί σε καρδιομεγαλία. Χρησιμοποιώντας την ανοσοϊστοχημεία και συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης για να μετρήσουμε το μέγεθος, την πυκνότητα και τον πολλαπλασιασμό των καρδιομυοκυττάρων, αποδεικνύεται ότι η μεγέθυνση της κοιλίας myh6-/- οφείλεται κατά κύριο λόγο στην υπερπλασία. Εντούτοις, εντοπίσαμε παρόμοια μεταγραφικά προφίλ στην απόκριση υπερτροφίας θηλαστικών μέσω RT-PCR των υπερπλαστικών κοιλιών. Περαιτέρω, δείχνουμε την ενεργοποίηση της οδού του στρες-ΕΔ με ανάλυση ανοσοαποτυπώματος κατά Western. Συμπερασματικά, μπορούμε να υποθέσουμε, με βάση το μοντέλο μας, ότι μονοπάτια μοριακής σηματοδότησης που συνδέονται με την υπερτροφία στα θηλαστικά, σε συνδυασμό με την ενεργοποίηση του στρες-ΕΔ, καταλήγουν σε υπερπλασία στο zebrafish. Επιπλέον, αυτή είναι η πρώτη φορά που αναφέρθηκε η εναπόθεση ελαστίνης στον κόλπο. Παράλληλα, μελετήθηκαν μικρά μόρια που αναστέλλουν την αγγειογένεση και είναι ελπιδοφόρα υποψήφια φάρμακα για τον καρκίνο, τις αμφιβληστροειδοπάθειες και τον εκφυλισμό της ωχράς κηλίδας που σχετίζεται με την ηλικία. Η in vivo φαινοτυπική διαλογή σε zebrafish (Danio rerio) αναδεικνύεται ως μια ισχυρή μεθοδολογία για την ταυτοποίηση και βελτιστοποίηση νέων ενώσεων με φαρμακολογική δράση. Το zebrafish παρέχει αρκετά πλεονεκτήματα για τις in vivo φαινοτυπικές παρατηρήσεις ειδικά για την αγγειογένεση, καθώς αναπτύσσεται ταχέως και δεν βασίζεται σε λειτουργικό καρδιαγγειακό σύστημα για να επιβιώσει για αρκετές ημέρες κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιούμε μια διαγονιδιακή σειρά που επιτρέπει τη μη επεμβατική παρακολούθηση της αγγειογένεσης σε κυτταρικό επίπεδο. Η αναστολή της αγγειογένεσης μπορεί να παρατηρηθεί κάτω από ένα στερεοσκόπιο φθορισμού και να ποσοτικοποιηθεί. Εκμεταλλευόμενοι τις δυνάτοτητες του zebrafish, χρησιμοποιήσαμε μια σειρά από 60 καινοτόμες ενώσεις που σχεδιάστηκαν με βάση την αναστολή του υποδοχέα VEGFR2. Στα πειράματα αυτά μπορεί να να υπολογιστεί η συγκέντρωση στην οποία προκαλείται τοξικότητα και να καταδειχθούν πιθανές παρενέργειες των υπό εξέταση ουσιών. Με αυτόν τον τρόπο αποκαλύφθηκαν 6 αντιστρεπτοί αναστολείς της αγγειογένεσης. Τέλος, στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής επιχειρήθηκε να ανιχνευθούν γονίδια τα οποία παίζουν ρόλο στη μορφογένεση των καρδιακών βαλβίδων και να αποδειχθεί η σχέση τους μέσω στοχευμένης μεταλλαξιγένεσης με τη βοήθεια του συστήματος CRISPR-Cas και να δημιουργηθεί μια διαγονιδιακή σειρά zebrafish που να αποκρίνεται στις αλλαγές της διατμητικής τάσης. Συμπερασματικά, από την παρούσα διατριβή προκύπτει η μεγάλη δυνατότητα του zebrafish για ανασύσταση/αναδιαμόρφωση της καρδιάς του σε παθολογικές καταστάσεις και αποδεικνύεται η ικανότητά του να χρησιμοποιείται ως ιδανικό μοντέλο για τη μελέτη των καρδιαγγειακών παθήσεων.