Required base complementarity between guide RNAs and target sequences in the CRISPR-Cas-based virus defense mechanism of the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus

Mittels CRISPR/Cas-Systemen erwerben Mikroorganismen Immunität gegen Infektion durch Viren und Eindringen anderer exogener Nukleinsäuren. Der CRISPR/Cas Mechanismus beruht auf der spezifischen Erkennung eindringender Fremd-DNA durch kleine, komplementäre RNAs, die als transkribierte Spacer-Sequenzen aus dem CRISPR locus als CRISPR RNAs (crRNAs) hervorgehen und einen so-genannten Protospacer erkennen, d.h. einen Sequenzabschnitt invasiver Nukleinsäuren, welcher Homologie zu einem Spacer aufweist. Im Gegenzug können Viren durch den Erwerb von Mutationen innerhalb ihrer Protospacer-Sequenz einer möglichen DNA Degradation entkommen und somit die erworbene Resistenz ihres Wirtsorganismus umgehen. Bislang wurden die Auswirkungen von Protospacermutationen auf die CRISPR/Cas-basierende Interferenz vor allem in bakteriellen CRISPR/Cas Systemen untersucht. Um mehr über die Anforderungen für die Interaktion zwischen crRNA und Protospacer während der CRISPR/Cas-Interferenz in Archaea zu lernen, wurde der hyperthermophile Crenarchaeote Sulfolobus solfataricus und sein Virus SSV1 als Modellsystem in dieser Studie verwendet. Für die Arbeit wurden verschiedene Protospacermutanten des rekombinanten Virus SSV1 hergestellt und anschließend in mehreren Transfektionsexperimenten untersucht. Die gentechnisch-veränderten Mutanten trugen eine steigende Anzahl an Mutationen an den jeweiligen Enden der Protospacer-Sequenz; d.h. im Ausmaß von sechs bis 18 aufeinander folgenden Mutationen an beiden Protospacerenden. Trotz der eingeführten sechs Mutationen am „down“-Ende des Protospacers, welches dem 3‘-Ende transkribierter Spacer RNA entspricht, vermittelte das S. solfataricus CRISPR/Cas System beinahe 100% Immunität gegen das rekombinante Virus. Im Gegensatz dazu, wurde die Resistenz gegen das rekombinante Virus stark vermindert (um 75%), als sechs Mutationen am anderen Ende („up“-Ende) des Protospacers eingeführt wurden. Es konnten immer noch 50% CRISPR/Cas-basierende Immunität nachgewiesen werden, als 15 aufeinander folgende Mutationen am Protospacer „down“-Ende vorhanden waren. Ähnlich den erst kürzlich angestellten Beobachtungen in E. coli, erwies sich das CRISPR/Cas System als deutlich toleranter gegenüber Mutationen, die am „down“-Ende des Protospacers auftraten. Dies deutet darauf hin, dass CRISPR/Cas-Interferenz in S. solfataricus durch die Erkennung einer kurzen Sequenz am „up“-Ende des Protospacers initiiert wird. Verglichen mit dem bakteriellen System, schien die erforderliche Basenkomplementarität zwischen Zielsequenz und crRNA während der CRISPR/Cas-Interferenz jedoch sehr gering zu sein.