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Parageobacillus thermoglucosidasius Strain Engineering Using a Theophylline Responsive RiboCas for Controlled Gene Expression

拉伤 茶碱 基因工程 基因 基因表达 计算生物学 生物 分子生物学 遗传学 重组DNA 药理学 解剖
作者
Matthew S. H. Lau,Abubakar Madika,Ying Zhang,Nigel P. Minton
出处
期刊:ACS Synthetic Biology [American Chemical Society]
标识
DOI:10.1021/acssynbio.3c00735
摘要

The relentless increase in atmospheric greenhouse gas concentrations as a consequence of the exploitation of fossil resources compels the adoption of sustainable routes to chemical and fuel manufacture based on biological fermentation processes. The use of thermophilic chassis in such processes is an attractive proposition; however, their effective exploitation will require improved genome editing tools. In the case of the industrially relevant chassis Parageobacillus thermoglucosidasius, CRISPR/Cas9-based gene editing has been demonstrated. The constitutive promoter used, however, accentuates the deleterious nature of Cas9, causing decreased transformation and low editing efficiencies, together with an increased likelihood of off-target effects or alternative mutations. Here, we rectify this issue by controlling the expression of Cas9 through the use of a synthetic riboswitch that is dependent on the nonmetabolized, nontoxic, and cheap inducer, theophylline. We demonstrate that the riboswitches are dose-dependent, allowing for controlled expression of the target gene. Through their use, we were then able to address the deleterious nature of Cas9 and produce an inducible system, RiboCas93. The benefits of RiboCas93 were demonstrated by increased transformation efficiency of the editing vectors, improved efficiency in mutant generation (100%), and a reduction of Cas9 toxicity, as indicated by a reduction in the number of single nucleotide polymorphisms (SNPs) observed. This new system provides a quick and efficient way to produce mutants in P. thermoglucosidasius.
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