Metformin inhibits ultraviolet A-induced photoaging of HaCaT cells by activating the adenosine monophosphate-activated protein kinase/nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 signaling pathway

摘要： 【摘要】 目的 研究二甲双胍对长波紫外线（UVA）所致人永生化角质形成细胞系（HaCaT）光老化的影响及机制。方法 采用细胞计数（CCK8）法测定不同浓度（0 ~ 100 mmol/L）二甲双胍对HaCaT细胞活力的影响，选择10 mmol/L二甲双胍进行后续实验。将培养的HaCaT细胞分为空白对照组、二甲双胍组、UVA照射组和二甲双胍 + UVA组（用含10 mmol/L二甲双胍的培养基处理24 h后采用UVA照射细胞），其中UVA每天以10 J/cm2照射1次，连续照射3 d。共处理4 d后收集细胞，β半乳糖苷酶法测定各组衰老细胞比例，2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯法测定胞内活性氧（ROS）水平，彗星实验测定DNA损伤水平。另将培养的HaCaT细胞分为空白对照组、二甲双胍组、1.25 μmol/L多索吗啡（dorsomorphin） + 二甲双胍组、2.5 μmol/L dorsomorphin + 二甲双胍组，其中后两组分别采用1.25、2.5 μmol/L dorsomorphin处理细胞2 h后再用10 mmol/L二甲双胍处理24 h，Western印迹法检测核转录因子E2相关因子2（Nrf2）的细胞定位及磷酸化水平。使用小干扰RNA（siRNA）法将siRNA-Nrf2转染至HaCaT细胞以敲低Nrf2表达（siRNA-Nrf2组），对2.5 μmol/L dorsomorphin处理的HaCaT细胞以及Nrf2敲低的HaCaT细胞进行二甲双胍孵育和UVA照射（dorsomorphin + 二甲双胍 + UVA组、siRNA-Nrf2 + 二甲双胍 + UVA组），进一步分析各组衰老细胞比例。统计分析采用单因素方差分析及两因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。结果 不同浓度二甲双胍处理24 h可不同程度地影响HaCaT细胞活力（F = 5 206.31，P ＜0.001），其中10 ~ 20 mmol/L二甲双胍组细胞相对存活率与对照组（0 mmol/L二甲双胍组）相比差异无统计学意义（均P > 0.05），而25 ~ 100 mmol/L二甲双胍组细胞相对存活率显著低于对照组（均P < 0.05）。UVA照射后HaCaT细胞发生明显皱缩且变狭长，细胞间隙增大，UVA照射组细胞相对存活率（76.13% ± 1.03%）显著低于空白对照组（100.00% ± 1.24%，LSD-t = 14.86，P < 0.001），而二甲双胍 + UVA组细胞存活率（106.69% ± 2.45%）显著高于UVA照射组（LSD-t = 11.55，P < 0.001）。此外，UVA照射组衰老细胞比例（45.14% ± 4.98%）、胞内ROS水平（144.61% ± 4.91%）、细胞核尾部DNA百分比（75.33% ± 1.77%）均显著高于空白对照组（23.84% ± 1.89%、55.49% ± 1.57%、1.88% ± 0.29%，均P < 0.001），而二甲双胍 + UVA组衰老细胞比例（24.26% ± 1.34%）、胞内ROS水平（58.62% ± 2.17%）、细胞核尾部DNA百分比（15.83% ± 1.23%）均显著低于UVA照射组（均P < 0.001）。Western印迹结果显示，10 mmol/L二甲双胍组细胞质中Nrf2表达低于空白对照组，细胞核中磷酸化Nrf2表达高于空白对照组，二甲双胍可有效诱导Nrf2的磷酸化，并诱导其核转位；经dorsomorphin预处理后，1.25、2.5 μmol/L dorsomorphin均能明显降低10 mmol/L二甲双胍诱导的AMPKα和Nrf2磷酸化水平。dorsomorphin + 二甲双胍 + UVA组、siRNA-Nrf2 + 二甲双胍 + UVA组衰老细胞比例分别为67.84% ± 2.74%和65.94% ± 1.33%，均显著高于二甲双胍 + UVA组（37.76% ± 1.64%，t值分别为14.45、13.34，均P < 0.001）。结论 二甲双胍可能通过激活AMPK/Nrf2信号通路，清除ROS和减少DNA损伤，从而抑制UVA诱导的HaCaT细胞光老化。