Rational strategy for studying microbiome of the ocular surface of people using hard contact lenses by method of 16S rRNA gene metabarcoding

The study is based on the hypothesis that high taxonomic diversity of bacteria detectable on the eye surface by molecular genetic methods is attributed to the high level of its contamination by skin microflora. Such contamination would make it problematic to identify the fractions of real ocular surface microbiome, which remains behind the one-percent cut-off threshold adopted in the metagenomic analysis. Hard contact lenses for long-wearing act as a physical filter preventing DNA contamination from random microorganisms, and at the same time providing adhesion to the living cells of bacteria and fungi. To confirm this assumption, a detailed analysis of references was carried out, supplemented by original laboratory research.The analysis included 16 hard contact lenses obtained from 11 patients with impaired refraction (myopia). Additionally, conjunctival mucosa scrapings were collected from 42 patients. Samples were cross-analyzed by 16S rRNA gene sequencing using 454 GS Junior (Ion Torrent) and Illumina MiSeq platforms.Results obtained by the Illumina platform (analysis of the V3-V4 variable region of the 16S rRNA gene) showed better convergence with the data of culture tests reported in the literature. The major microorganism groups found were: Acinetobacter (39%), Gluconacetobacter (10.8%), Propionibacterium (9.3%), Corynebacterium (9.3%), Staphylococcus (7.2%), Streptococcus (7%), Pseudomonas (4.1%), Micrococcus (3.3%), Yersinia (3%), Chondromyces (2.4%), Serratia (2.3%), and Bacillus (2.1%). Analysis of the samples obtained directly from the mucosa revealed dominance of typical skin-associated microorganisms.The present study proposes a contamination-reduction algorithm for microbiological testing of the ocular surface using hard contact lenses for prolonged wearing as a carrier for microbial DNA.Исследование базируется на предположении о том, что существенное таксономическое многообразие бактерий, выявляемое на слизистой оболочке глазной поверхности методами молекулярно-генетического анализа, связано с ее систематической контаминацией кожной микрофлорой. Это затрудняет выявление фракций реального микробиома глазной поверхности, которые остаются за принятым в метагеномном анализе однопроцентным порогом отсечения. В роли физического фильтра для предотвращения захвата остатков ДНК случайных микроорганизмов, одновременно обеспечивающего адгезию живых клеток бактерий и грибов, могут выступать контактные линзы длительного ношения. Для подтверждения этого предположения был проведен детальный анализ литературы, дополненный собственными лабораторными исследованиями.Всего в анализ вошло 16 жестких контактных линз, полученных от 11 пациентов с миопией. Также у 42 пациентов были получены соскобы слизистой оболочки конъюнктивы. Образцы были перекрестно проанализированы методом метабаркодинга гена 16S рибосомальной РНК (рРНК) на платформах 454 GSJunior (IonTorrent) и Illumina MiSeq.Лучшую сходимость с данными культуральных тестов, описанных в литературе, показало использование платформы Illumina (при анализе V3—V4-вариабельного региона гена 16S рРНК). Было подтверждено наличие: Acinetobacter (39%), Gluconacetobacter (10,8%), Propionibacterium (9,3%), Corynebacterium (9,3%), Staphylococcus (7,2%), Streptococcus (7%), Pseudomonas (4,1%), Micrococcus (3,3%), Yersinia (3%), Chondromyces (2,4%), Serratia (2,3%), Bacillus (2,1%). Анализ образцов, полученных непосредственно со слизистой оболочки, выявил доминирование микроорганизмов, характерных для кожи.В данной работе предложен алгоритм анализа микробиологической пробы, полученной с глазной поверхности с использованием жестких контактных линз длительного ношения в качестве носителя микробной ДНК, для снижения влияния контаминирующих бактерий.