基因编辑技术对大肠杆菌 yjjW 基因点突变的两步法策略

目的为了实现对大肠杆菌靶基因的点突变，本研究将同源重组系统与CRISPR-Cas9技术相结合，探索一种高效、简捷的两步法策略。 方法将靶基因的上下游同源臂和标记基因（amp）与pKOV质粒连接，获得pKOV-HR重组质粒。将pKOV-HR转化至大肠杆菌，借助其自身RecA重组系统，介导DNA发生同源重组，获得靶基因敲除菌株。随后，靶基因的点突变采用pSGKP-km和pCasKP-apr双质粒系统。首先，设计与amp结合具有定向引导作用的spacer序列，并利用overlap PCR获得带有靶基因点突变的同源臂，将spacer和同源臂与pSGKP-km质粒连接，获得重组质粒pSGKP-km-spacer-HR；接着，将pSGKP-km-spacer-HR和pCasKP-apr质粒转化至上述敲除菌株；最后，利用质粒表达的Cas9切割蛋白和λ-Red重组蛋白，发生DNA同源重组，获得靶基因点突变菌株。 结果利用上述方法，既成功获得了大肠杆菌yjjW敲除菌株D7ΔyjjW：：ampR，又实现了yjjW第24位碱基T到C的点突变，获得点突变菌株D7yjjW-24。 结论本研究建立了一种高效、简捷的大肠杆菌靶基因点突变方法，amp基因的插入提供了有效的筛选标记，此外该方法建立的重组质粒pSGKP-km-spacer，可应用于同种菌株其他靶基因的点突变，能够缩短后续实验操作，为基因编辑技术的发展提供了科学理论以及实验操作基础。