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基因编辑技术对大肠杆菌 yjjW 基因点突变的两步法策略
计算机科学
作者
张琦,
Qi Zhang,
梁雅静,
Liang Yajing,
张宇馨,
Yuxin Zhang,
陈玲慧,
Linghui Chen,
韩钟娆,
Han Zhongrao,
李蓓蓓,
Beibei Li,
金一,
Y. Jiang,
何晓青,
Xiaoqing He
链接
ijournals.cn
doi.org
标识
DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.20200151
摘要
目的为了实现对大肠杆菌靶基因的点突变,本研究将同源重组系统与CRISPR-Cas9技术相结合,探索一种高效、简捷的两步法策略。 方法将靶基因的上下游同源臂和标记基因(amp)与pKOV质粒连接,获得pKOV-HR重组质粒。将pKOV-HR转化至大肠杆菌,借助其自身RecA重组系统,介导DNA发生同源重组,获得靶基因敲除菌株。随后,靶基因的点突变采用pSGKP-km和pCasKP-apr双质粒系统。首先,设计与amp结合具有定向引导作用的spacer序列,并利用overlap PCR获得带有靶基因点突变的同源臂,将spacer和同源臂与pSGKP-km质粒连接,获得重组质粒pSGKP-km-spacer-HR;接着,将pSGKP-km-spacer-HR和pCasKP-apr质粒转化至上述敲除菌株;最后,利用质粒表达的Cas9切割蛋白和λ-Red重组蛋白,发生DNA同源重组,获得靶基因点突变菌株。 结果利用上述方法,既成功获得了大肠杆菌yjjW敲除菌株D7ΔyjjW::ampR,又实现了yjjW第24位碱基T到C的点突变,获得点突变菌株D7yjjW-24。 结论本研究建立了一种高效、简捷的大肠杆菌靶基因点突变方法,amp基因的插入提供了有效的筛选标记,此外该方法建立的重组质粒pSGKP-km-spacer,可应用于同种菌株其他靶基因的点突变,能够缩短后续实验操作,为基因编辑技术的发展提供了科学理论以及实验操作基础。
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