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Site-Specific Biotinylation of Purified Proteins Using BirA

生物素化 生物素 DNA连接酶 亲和素 生物化学 链霉亲和素 化学 共价键 有机化学
作者
M. Fairhead,Mark Howarth
出处
期刊:Methods in molecular biology 卷期号:: 171-184 被引量:311
标识
DOI:10.1007/978-1-4939-2272-7_12
摘要

The binding between biotin and streptavidin or avidin is one of the strongest known non-covalent biological interactions. The (strept)avidin-biotin interaction has been widely used for decades in biological research and biotechnology. Therefore labeling of purified proteins by biotin is a powerful way to achieve protein capture, immobilization, and functionalization, as well as multimerizing or bridging molecules. Chemical biotinylation often generates heterogeneous products, which may have impaired function. Enzymatic biotinylation with E. coli biotin ligase (BirA) is highly specific in covalently attaching biotin to the 15 amino acid AviTag peptide, giving a homogeneous product with high yield. AviTag can conveniently be added genetically at the N-terminus, C-terminus, or in exposed loops of a target protein. We describe here procedures for AviTag insertion by inverse PCR, purification of BirA fused to glutathione-S-transferase (GST-BirA) from E. coli, BirA biotinylation of purified protein, and gel-shift analysis by SDS-PAGE to quantify the extent of biotinylation.
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