Digestión de proteínas alimentarias y señalización de péptidos para la liberación de hormonas intestinales

En la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo el estudio de productos derivados de la digestión de proteínas alimentarias como inductores en la secreción de hormonas relacionadas con la saciedad en la línea celular enteroendocrina STC-1. Se han identificado algunas moléculas responsables en la secreción de estas hormonas y los receptores implicados en la señalización celular observada a nivel intestinal. Como sustratos se estudiaron digeridos gastrointestinales de caseína, proteínas de suero y clara de huevo, y péptidos sintetizados químicamente correspondientes a regiones resistentes a la digestión gastrointestinal mediante técnicas de espectrometría de masas en tándem. Inicialmente se estudió la liberación y expresión de colecistoquinina (CCK) y del péptido similar a glucagón tipo 1 (GLP-1) inducido por digeridos gastrointestinales in vitro de caseínas y proteínas de suero. Los digeridos gástricos e intestinales de ambos sustratos dieron lugar a la secreción de CCK, pero la respuesta fue máxima con los digeridos intestinales. Sin embargo, la secreción de GLP-1 se produjo con el digerido gástrico de caseína e intestinal de proteínas de suero. Para validar estos resultados, se ensayaron, en las mismas condiciones, muestras obtenidas en yeyuno humano tras la ingesta de los mismos sustratos. Los resultados con los digeridos in vitro y con las muestras humanas en la secreción y expresión de ambas hormonas fueron similares, lo que valida no sólo las condiciones del ensayo celular, sino también el protocolo de digestión gastrointestinal in vitro empleado. La excepción fue la secreción de GLP-1 con el digerido in vitro de caseína que no produjo respuesta significativa, mientras que la muestra de yeyuno sí, probablemente atribuible a una mayor degradación proteica en el proceso de digestión in vitro. Además, se ensayó una mezcla comercial de aminoácidos libres consiguiendo sólo un leve efecto en la secreción de GLP-1, por lo que el efecto secretagogo se atribuyó principalmente a la fracción peptídica. En base a estos resultados, se estudiaron digeridos gastrointestinales in vitro de clara de huevo, así como fracciones de los mismos de diferentes tamaños moleculares en células STC-1 para confirmar si el tamaño de los péptidos podía influir en su capacidad secretagoga. La secreción de GLP-1 se produjo principalmente tras la incubación con péptidos con pesos moleculares superiores a 500 Da, aunque la proteína intacta también causó un ligero aumento de esta hormona. Sin embargo, ni la fracción de péptidos <500 Da ni la mezcla de aminoácidos libres produjeron un efecto significativo en su secreción. Por el contrario, los péptidos, y en menor medida los aminoácidos libres, indujeron la liberación de CCK, pero no la proteína intacta. Dado que son los péptidos, y sobre todo los péptidos >500 Da, los principales inductores de estas hormonas, se decidió sintetizar péptidos resistentes a la digestión gastrointestinal in vitro de clara de huevo, y péptidos lácteos identificados en duodeno porcino y en yeyuno humano. Se eligieron péptidos de diferente longitud y características estructurales tales como punto isoeléctrico (pI) e hidrofobicidad. Se ha podido observar que los péptidos con elevada hidrofobicidad y pI indujeron la secreción de GLP-1, pero no es la única condición ya que péptidos con las mismas características pero diferente secuencia aminoacídica, no produjeron ninguna respuesta, poniendo de manifiesto la relevancia de la secuencia. Esta hipótesis se demostró posteriormente con modificaciones en la secuencia de los péptidos inductores, donde la eliminación o intercambio de un aminoácido por otro resultó ser relevante en la respuesta de CCK y GLP-1. Asimismo, se avanzó en la identificación de los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) implicados en la secreción de estas hormonas empleando antagonistas del receptor sensible al calcio (CaSR) y GPR93. Los resultados mostraron que los inhibidores empleados revertían el efecto secretor de CCK y/o GLP-1 de algunos péptidos, poniendo de manifiesto la implicación del receptor en la señalización a nivel de las células enteroendocrinas. Otros péptidos, sin embargo, no vieron alterada su respuesta en presencia de los inhibidores, y, por tanto, bien podría existir otra ruta de señalización mediante otros receptores GPCRs o podría estar implicado este receptor mediante otro sitio de activación diferente al sitio de unión del antagonista empleado. Entre las distintas funciones que desempeñan las hormonas incretinas GLP-1 y polipéptido inhibidor gástrico (GIP) está el control de la homeostasis de glucosa mediante la estimulación de la liberación de insulina en las células pancreáticas. Sin embargo, estas hormonas se inactivan rápidamente por la enzima dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) por lo que aquellas moléculas que inhiban la actividad de la enzima provocarán un aumento de GLP-1 y/o GIP activo, estimulando la liberación de insulina. Por ello, se estudiaron los digeridos gastrointestinales de proteínas de suero y clara de huevo como inhibidores de la enzima DPP-IV, encontrando que los digeridos intestinales inhibían en mayor medida la actividad de la enzima que los digeridos gástricos. Dado que muchos estudios han señalado que las proteínas alimentarias incrementan los niveles de secreción de insulina en las células pancreáticas, se decidió evaluar el efecto de la fracción absorbible de estos digeridos gastrointestinales sobre los niveles de insulina. Para ello, se empleó un sistema bicompartimental con células pancreáticas BRIN-BD11 en la parte basolateral y una membrana epitelial compuesta por una monocapa de células Caco-2, o por un co-cultivo Caco-2/STC-1 en la parte apical. La fracción absorbible de los digeridos intestinales de ambos sustratos indujo la secreción de insulina. Sin embargo, mientras que la fracción de los digeridos gástricos que atraviesa la monocapa de Caco-2 no produjo ninguna respuesta en los niveles de insulina, esta misma fracción incubada el co-cultivo Caco-2/STC-1 aumentó los niveles de insulina de manera similar a los digeridos intestinales. Finalmente, se comparó la degradación proteica de cuatro aislados proteicos vegetales: guisante, almorta, soja y lenteja, y se identificaron los productos tras la digestión gastrointestinal in vitro. Además, se estudió la distribución de la fracción nitrogenada al final de la digestión gástrica e intestinal entre péptidos y aminoácidos libres. El contenido de nitrógeno de la fracción soluble y el perfil de aminoácidos libres se podría utilizar para comparar digestibilidad de los sustratos proteicos. Además, entre los péptidos identificados al final de la digestión gastrointestinal se detectaron secuencias previamente descritas con potencial alergénico. En conclusión, se ha demostrado el papel determinante que desempeñan los péptidos resistentes a la digestión gastrointestinal de proteínas alimentarias en la liberación de las hormonas CCK y GLP-1 en la línea celular enteroendocrina STC-1, y se ha avanzado en el conocimiento de los GPCRs implicados en la señalización de péptidos generados durante la digestión gastrointestinal.