Μοριακή επιδημιολογική διερεύνηση κλινικών στελεχών Campylobacter jejuni με τη μέθοδο τυποποίησης με βάση την αλληλουχία πολλαπλών γενετικών τόπων (MLST-Multilocus Sequence typing)

Εισαγωγή: Τα καμπυλοβακτηρίδια (Campylobacter spp.) αποτελούν παγκοσμίωςμαζί με τις σαλμονέλλες τα συχνότερα αίτια βακτηριακής γαστρεντερίτιδας. Σκοπόςτης παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της μοριακής επιδημιολογίας τουCampylobacter στην Ελλάδα, σε κλινικά στελέχη που απομονώθηκαν από παιδιά μεγαστρεντερίτιδα, εφαρμόζοντας τη μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίαςπολυγενετικού τόπου (Multilocus Sequence Typing, MLST).Υλικά και μέθοδοι: Χρησιμοποιήθηκαν 88 στελέχη Campylobacter spp. γνωστούοροτύπου και αντιμικροβιακής ευαισθησίας, των οποίων η απομόνωση και η αρχικήταυτοποίηση πραγματοποιήθηκαν με συμβατικές μεθόδους (καλλιέργεια σεεκλεκτικό υλικό Skirrow, μικροσκοπική εικόνα, υδρόλυση ιππουρικού οξέος, καιταυτοποίηση με το σύστημα εμπορίου API Campy). Όλα τα στελέχη τυποποιήθηκανμοριακά με: 1) ανάλυση του γονιδίου flaA («φλαγγελοτυπία»), 2) ηλεκτροφόρηση σεμεταβαλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE) και 3) βάσει τις αλληλουχίες εφτάδιαχειριστικών γονιδίων (MLST). Επίσης πραγματοποιήθηκε ταξινόμηση σε«γονοτύπους» με φυλογενετική ανάλυση η οποία στηρίχτηκε α) στα αποτελέσματατης PFGE μετατρέποντας τα ηλεκτροφορητικά πρότυπα σε δυαδικούς αριθμούς καιβ) στις αλληλουχίες των γονιδίων από την MLST. Πραγματοποιήθηκε στατιστικήανάλυση για να διερευνηθούν οι πιθανοί συσχετισμοί μεταξύ των γονοτυπικώνμεθόδων, καθώς επίσης και η πιθανή συσχέτιση αυτών με την αντοχή σε αντιβιοτικά.Αποτελέσματα-Συμπεράσματα: Η εφαρμογή των μοριακών τεχνικών ανέδειξε 33«φλαγγελότυπους», 42 PFGE τύπους και 55 MLST τύπους, αποκαλύπτοντας τηνυψηλή διακριτική ικανότητα της MLST μεθόδου έναντι των άλλων γονοτυπικώντεχνικών. Η MLST μέθοδος υπερέχει αφενός γιατί μπορεί να δώσει περισσότερουςγονότυπους και αφετέρου γιατί λόγω της ανάλυσης αλληλουχίας τα δεδομένα πουπροκύπτουν είναι άμεσα συγκρίσιμα με αυτά άλλων μελετών. Ποιο αναλυτικά, τουψηλό ποσοστό των 55 διαφορετικών STs (13 νέοι και 42 ήδη καταχωρημένοι) στα88 στελέχη που εξετάστηκαν, φανερώνει από επιδημιολογική σκοπιά ότι υπάρχειέντονη ST ποικιλομορφία εντός του συγκεκριμένου γένους στην περιοχή της Αττικής,επιβεβαιώνοντας την γενετική ποικιλομορφία του Campylobacter spp. και τηνσποραδικότητα των κρουσμάτων. Επίσης δεν παρατηρήθηκε επικράτηση κάποιουσυγκεκριμένου ST έναντι των άλλων. Όσον αφορά τα 7 διαχειριστικά γονίδια που χρησιμοποιήθηκαν σ’ αυτήν την τυποποίηση δεν παρατηρήθηκε στατιστικάσημαντική επικράτηση κάποιου αλληλόμορφου για το κάθε γονίδιο. Από τααποτελέσματα της MLST παρουσιάστηκαν 20 στελέχη που άνηκαν σε MLST τύπουςCampylobacter coli. Ακολούθησε φυλογενετική ανάλυση, η οποία έδειξε πως αυτάομαδοποιούνταν μόνα τους στατιστικά σημαντικά, σε διαφορετική φυλογενετικήομάδα (cluster) από τα υπόλοιπα στελέχη. Προς επιβεβαίωση των ανωτέρωναποτελεσμάτων, επαναλήφθηκε η κλασσική φαινοτυπική ταυτοποίηση με τηνυδρόλυση του ιππουρικού οξέος, τηρώντας πιστά τις οδηγίες πρόσφατων μελετώνπου έθιγαν το θέμα και πιστοποιήθηκε, ότι πράγματι αυτά τα στελέχη ήτανCampylobacter coli. Συμπερασματικά, οι μέθοδοι MLST και PFGE μας παρέχουνσημαντικές δυνατότητες αξιόπιστης τυποποίησης στελεχών Campylobacter γιαεπιδημιολογικές μελέτες, επιπλέον δε η μέθοδος MLST μπορεί να δώσει και πολύαξιόπιστες ταυτοποιητικές πληροφορίες. Η φυλογενετική ανάλυση είναι ένα πολύχρήσιμο εργαλείο για την επιβεβαίωση των ταυτοποητικών δυνατοτήτων της MLSTκαι την αποκάλυψη του γενετικού μωσαϊκού κάποιων στελεχών C. coli και C. jejuni.Επιπλέον, από την στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων της MLST μεθόδουπροέκυψαν στατιστικώς σημαντική συσχέτιση κάποιων συγκεκριμένωναλληλομόρφων γονιδίων με αντοχή σε συγκεκριμένα αντιβιοτικά, η οποία θέλειπεραιτέρω διερεύνηση. Τέλος δημιουργήθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα μια βάσηδεδομένων για Campylobacter spp. η οποία περιέχει χαρακτηριστικά υψηλούεπιδημιολογικού ενδιαφέροντος.