CRISPR/Cas9介导的猪IPEC-J2细胞 CD 13基因敲除细胞系的建立

旨在利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术制备CD13基因敲除的IPEC-J2（猪空肠上皮细胞系）细胞，揭示细胞表面分化抗原13（cluster of differentiation 13，CD13）在肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用。本研究在猪CD13基因第2外显子区域设计2个向导RNA（guide RNA，gRNA），命名为g3、g5，然后分别将g3和g5克隆到pX330-GFP和pX330-RFP载体骨架上，电转染IPEC-J2细胞，48 h后通过流式细胞术分选具有双荧光标记的细胞，培养并获得单克隆细胞，PCR扩增、测序，从而获得CD13基因纯合敲除的阳性细胞系。对获得的20个细胞单克隆进行PCR，并挑取部分克隆PCR产物测序，发现共有7个克隆发生了基因片段缺失，其中1个克隆为单等位基因片段缺失，3个克隆为双等位基因杂合片段缺失，3个克隆为双等位基因纯合片段敲除。本研究检测双等位基因纯合片段敲除细胞的蛋白表达水平，其结果显示，在该纯合敲除细胞中CD13蛋白几乎不表达，表明成功构建了CD13敲除的IPEC-J2细胞系。本研究获得的CD13基因敲除细胞系为探究CD13在猪肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用奠定了基础。