Optimising preparation of intestinal mucosal tissue and intestinal contents to study effects of "Akkermansia spp." supplementation during dextran sulfate sodium-induced colitis in mice

Der Gastrointestinaltrakt enthält 1012 bis 1014 Bakterien. Es wird angenommen, dass allein im Dickdarm 70 % aller im humanen Körper enthaltenen Mikroben gefunden werden können. Eine Störung dieser Darmflora wurde mit chronisch entzündlichen Darmkrankheiten, wie Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa in Zusammenhang gebracht. Als solche Veränderung der Darmflora wird die Verminderung der Anzahl an mucusabbauenden Akkermansia muciniphila gehandelt. Deshalb wird angenommen, dass eine Supplementierung von probiotischen Akkermansia spp. positive Auswirkungen auf eine Natrium-Dextransulfat (DSS)-induzierte Colitis hat. Das Projektteam hat beobachtet, dass die Supplementierung von C57BL/6 WT Mäusen mit lebensfähigen humanen H2- und MucT-Akkermansia zu einem starken Gewichtsverlust in den ersten Tagen führte, wobei diese Mäuse vier Tage nach Beginn der Verabreichung, als Akkermansia-DNA auch in einer quantitative PCR nachweisbar war, wieder an Gewicht zunahmen. Hitzeinaktivierte (HI) und lebensfähige Akkermansia des MG-(Maus)-Stammes, sowie alle anderen HI-Stämme hatten im Vergleich zur Kontrollgruppe keine positiven oder negativen Auswirkungen auf das durchschnittliche Gewicht, weder vor, noch während der DSS-induzierten Entzündung. Bei der Evaluierung von Dickdarmgewebedünnschnitten mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) konnte die Rekolonisierung des Dickdarms durch Akkermansia spp. in allen Gruppen, außer in der Kontrollgruppe, nachgewiesen werden. Allerdings wurde kein relevanter Zusammenhang zwischen der Anwesenheit von Akkermansia spp. und dem Entzündungsgrad nachgewiesen. Darüber hinaus konnten die mucinabbauenden Bakterien nicht, wie erwartet, ausschließlich an der intestinalen Mucusschicht nachgewiesen werden, sondern diese verteilten sich über das gesamte Darmlumen. Für eine bessere Bewertung des Zusammenhangs zwischen der Anwesenheit von Akkermansia spp. im Dickdarm und der Störung der Darmschleimhaut ist eine Kombinationsfärbung von beiden notwendig. Der Hauptbestandteil von Mucus ist Wasser (> 98 %), dadurch ist eine Visualisierung mittels Mikroskop schwierig. Neun verschiedene Fixiermittel und unterschiedliche Färbemethoden wurden getestet, um die besten Bedingungen für die optimale Gewebe- und Schleimhauterhaltung, sowie gute Signalintensität mittels FISH zu finden. FISH wurde auf fixiertem Blinddarminhalt mit der allgemeinen Sonde EUBmix I – III und den spezifischen Sonden für Bacteroidales und Clostridium clusters XIVa und XIVb durchgeführt. Mittels DAIME wurde deren Average Volume Fraction und Signalintensitäten ermittelt. Auf Signalintensität und Strukturerhaltung während einer Alzianblaufärbung bezogen, lieferten Fixierung mit 4 % PFA, 6/3/1 wasserfreiem EtOH-Carnoy und 6/6/1 MetOH-Carnoy die besten Ergebnisse. Da die Färbung der Darmschleimhaut mit Alzianblau aber nicht mit FISH kombinierbar ist, wurden immunhistochemische Färbemethoden mit dem Lektin Jacalin aus der Jackbaumfrucht und mit dem mucinspezifischen Anti-MUC2-Antikörper getestet. Die Lektinmarkierung lieferte keine klare Färbung der intestinalen Mucusschicht, die Antikörpermarkierung von MUC2 hingegen führte zu einer eindeutigen Färbung der Mucusbarriere, des Bürstensaums und der Becherzellen. Um symbiotische Bakterien zu lokalisieren, konnten durch die Kombination von MUC2-Antikörperfärbung und FISH keine zufriedenstellenden Signalintensitäten der Sonden erzielt werden.