Isolation and cellular characterization of the hemolysin A type 1 secretion system from Escherichia coli

Sekretionssysteme sind essentielle Nanomaschinen in Gram-negativen Bakterien. Sie erlauben die Kommunikation aus der Zelle uber den Transport von Proteinen und Signalmolekulen. Das Typ eins Sekretionssystem (T1SS) ist ein Paradebeispiel fur Sekretionssysteme in Gram-negativen Bakterien. Das T1SS kann eine Vielfalt an Substraten uber beide Membranen, in den extrazellularen Raum, transportieren. Die Substrate konnen in ihrer Grose von 19 kDa bis 1.5 MDa stark variieren. Dies gilt auch fur ihre Funktionen der Substrate: Hamophore, Lipasen, Adhesionsfaktoren, Oberflachenproteine und Toxine. Die Substrate teilen gemeinsame Merkmale. Ein C-terminales Sekretionssignal das nicht wahrend des Transports entfernt wird, wahrend das Substrate in einem ungefalteten Zustand transportiert wird. Ein bekanntes Beispiel fur T1SS ist das Hemolysin A (HlyA) T1SS. Es besteht aus dem ABC Transporter Hemolysin B (HlyB), einem Membranfusionsprotein (MFP) Hemolysin D, dem auseren Membranprotein (OMP) TolC und dem Substrat HlyA, welches zur repeats in toxins (RTX) Familie gehort. In der Anwesenheit von HlyA wird durch den inneren Membrankomplex (IMC), bestehend aus HlyB und HlyD das OMP TolC rekrutiert und ein Translokalisationspfad wird durch beide Membranen gebildet Wahrend der Forschung fur diese Doktorarbeit wurde die Sekretionsrate des HlyA T1SS quantifiziert und der Einfluss von Calcium Ionen untersucht. Dazu wurde ein N-terminales Fusionskonstrukt aus HlyA mit einem schnell faltenden GFP verwendet, dass es ermoglicht das HlyA T1SS wahrend der Translokation zu arretieren. Dieser experimentelle Aufbau ermoglicht die Quantifizierung von ca. 5000 aktiven HlyA T1SS wahrend der Uberexpression im Laborstamm E. coli BL21(DE3). Die Sekretion von HlyA in Kulturmedium wurde anschliesend in Anwesenheit bzw. Abwesenheit verschiedener Calciumionenkonzentrationen beobachtet. Durch die Zahl der aktiven T1SS war es dadurch moglich die Sekretionsrate des HlyA T1SS mit 16 Aminosauren pro Transporter und Sekunde zu bestimmen. Die Sekretionsrate ist unbeeinflusst vom Verhaltnis von Proteinlange zur Menge der Glycin reichen Wiederholungen und der extrazellularen Calciumionenkonzentration. Mittels Fluoreszenzmikroskopie wurde die Oberflachenlokalisation der arretierten T1SS charakterisiert. Zur Beurteilung des Oberflachenverteilungsmusters wurde der parentale E. coli Stamm UTI89 verwendet. In UTI89 steht das HlyA T1SS unter endogener Expressionskontrolle und wurde untersucht, wahrend es mit dem GFP fusionierten HlyA arretiert wurde. Unabhangig von der Uberexpression in BL21(DE3) oder der endogenen Expression in UTI89 war fur das HlyA T1SS keine eindeutige Lokalisation auf der Zelloberflache zu beobachten. Zusatzlich wurde der arretierte Komplex verwendet, um die Menge an aktivem HlyA T1SS in UTI89 zu bestimmen. Wahrend der endogenen Expression wurden etwa 800 aktive HlyA T1SS quantifiziert, verglichen mit etwa 5000 T1SS, die in BL21(DE3) uberexprimiert wurden. Weiterhin wurde der Einfluss der TolC Arretierung durch das HlyA T1SS untersucht. Die Zahl der TolC-Trimere wurde quantifiziert wahrend der Expression des HlyA T1SS auf endogenem, uberexprimiertem Niveau und dessen abwesenheit. Die Anzahl an TolC waren mit etwa 5000 Trimeren unabhangig vom Besetzungsanteil nicht signifikant beeinflusst. Zuletzt wurde die mogliche Aufreinigung des arretierte T1SS untersucht. Es wurde gezeigt, dass es moglich ist Membranen mit dem T1SS zu isolieren und solubilisieren allerdings ist die Stabilitat des Komplexes wahrend der Reinigung nicht gewahrleistet. Einfuhrung von Quervernetzung fuhrte zu einer Vielzahl an Quervernetzungsprodukten, weshalb neue Methoden fur die Reinigung vorgeschlagen werden.