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A PCR-directed cell-free approach to optimize protein expression using diverse fusion tags

融合蛋白 生物 融合基因 基因 计算生物学 重叠延伸聚合酶链反应 分子生物学 遗传学 重组DNA
作者
Andrew V. Kralicek,Mazdak Radjainia,Nazratul A.B. Mohamad Ali,Colm Carraher,Richard D. Newcomb,Alok K. Mitra
出处
期刊:Protein Expression and Purification [Elsevier]
被引量:12
标识
DOI:10.1016/j.pep.2011.06.006
摘要

N-terminal fusion tags that enhance translation initiation or protein solubility are often used to facilitate protein overexpression. As the optimal tag for a given target protein cannot be predicted a priori, valuable time can be lost in cloning and manipulating the corresponding gene to generate different fusion constructs for expression analysis. We have developed a cell-free strategy that consolidates these steps, enabling the utility of a panel of nine fusion-tags to be determined within one to two days. This approach exploits the fact that PCR-amplified DNA can be used as a template for cell-free protein synthesis. Overlap/extension PCR using the TEV protease site as the overlap region allows the fusion of different T7 promoter (T7p)-tag-TEV DNA fragments with a TEV-gene-T7 terminator (T7ter) fragment. For tag sequences where the TEV site is not compatible, a short C₃G₃ repeat (CGr) sequence can be used as the overlap region. The resulting T7p-tag-TEV-gene-T7ter constructs are then used as templates for PCR-directed cell-free protein synthesis to identify which tag-TEV-gene fusion protein produces the highest amount of soluble protein. We have successfully applied this approach to the overexpression of the Adiponectin hypervariable domain (AHD). Five of the nine N-terminal fusion tags tested enabled the synthesis of soluble recombinant protein. The best of these was the Peptidyl-prolylcis-trans isomerise B (PpiB) fusion tag which produces 1mg/ml amounts of soluble fusion protein. PpiB is an example of a new class of fusion tag known as the "stress-responsive proteins". Our results suggest that this cell-free fusion-tag expression screen facilitates the rapid identification of suitable fusion-tags that overcome issues such as poor expression and insolubility, often encountered using conventional approaches.
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