Fluorescent Polysome Profiling in Caenorhabditis elegans

An important but often overlooked aspect of gene regulation occurs at the level of protein translation. Many genes are regulated not only by transcription but by their propensity to be recruited to actively translating ribosomes (polysomes). Polysome profiling allows for the separation of unbound 40S and 60S subunits, 80S monosomes, and actively translating mRNA bound by two or more ribosomes. Thus, this technique allows for actively translated mRNA to be isolated. Transcript abundance can then be compared between actively translated mRNA and all mRNA present in a sample to identify instances of post-transcriptional regulation. Additionally, polysome profiling can be used as a readout of global translation rates by quantifying the proportion of actively translating ribosomes within a sample. Previously established protocols for polysome profiling rely on the absorbance of RNA to visualize the presence of polysomes within the fractions. However, with the advent of flow cells capable of detecting fluorescence, the association of fluorescently tagged proteins with polysomes can be detected and quantified in addition to the absorbance of RNA. This protocol provides detailed instructions on how to perform fluorescent polysome profiling in C. elegans to collect actively translated mRNA, to quantify changes in global translation, and to detect ribosomal binding partners., [摘要 ] 基因调控的一个重要但经常被忽视的方面发生在蛋白质翻译的水平。许多基因不仅受转录调控，还受其被募集以主动翻译核糖体（多核糖体）的倾向性的调节。多核糖体分析允许分离未结合的40S和60S亚基，80S单核糖体，并主动翻译由两个或多个核糖体结合的mRNA。因此，该技术允许分离出主动翻译的mRNA。然后可以在主动翻译的mRNA和样品中存在的所有mRNA之间比较转录本丰度，以鉴定转录后调控的实例。此外，多核糖体分析可以用作ar 通过量化样品中活性翻译核糖体的比例来确定总体翻译率。先前建立的多核糖体谱分析方案依赖于RNA的吸收来可视化级分中多核糖体的存在。但是，随着能够检测荧光的流通池的出现，除了RNA的吸收以外，还可以检测和定量荧光标记的蛋白质与多核糖体的结合。该协议提供了有关如何在秀丽隐杆线虫中进行荧光多核糖体分析以收集主动翻译的mRNA，定量整体翻译的变化以及检测核糖体结合伴侣的详细说明。[背景 ] 绑定到同一个mRNA转录多积极核糖体的翻译被称为多聚核糖体。可使用多核糖体分析将多核糖体与其他核糖体形式和未结合的mRNA分离。P olysome 分析已经在蛋白质翻译领域的关键技术。与mRNA的-SEQ的同时，多边形OME分析允许由转录后机制调节以进行检测和定量转录物（兰等人，2019;罗林。等人，2019） ，通过定量PCR （熊猫等人， 2017）。通过在不同条件下定量与多核糖体相关的RNA，多核糖体谱也已被用作全球翻译率的读数（Merret 等，2015 ；Chassé 等，2017 ）。另外，多核糖体分析已经被用于分离包含多核糖体的蛋白质，并允许使用诸如蛋白质印迹的技术来探测其内容物（Tiedje 等人，2012；Jin 和Xiao，2018）。 这种多核糖体谱分析方案在两个方面与先前发表的方案不同。它是专门为秀丽隐杆线虫开发的，它使用荧光来检测荧光标记的蛋白质与多核糖体的结合。与细胞培养物或收获的组织相比，秀丽隐杆线虫的表皮在创建用于多核糖体图谱的裂解物时需要额外考虑。 现有的多核糖体谱分析方法允许检测目标蛋白质和活性核糖体之间的结合。但是，这需要从多核糖体级分中提取蛋白质，并使用蛋白质印迹法检测目标蛋白质。为了解决目标蛋白质与不同形式的核糖体（4 0S，60S，单核糖体，多核糖体）之间的缔合差异，需要从每个样品中收集并探测多个馏分（图1）。取而代之的是，使用能够检测荧光的流通池，可以检测到荧光标记的蛋白，并在整个图谱中进行定量分析。因此，以高分辨率捕获了标记蛋白与所有形式的核糖体之间的缔合，并且消除了蛋白质印迹的需要。以下多核糖体谱分析方案将涵盖如何使用秀丽隐杆线虫的裂解物制备，加载，离心和扫描蔗糖梯度（图2）。另外，给出了定量多核糖体谱中活性翻译核糖体比例的说明。 D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902828--1508 Jarod Rollins 810785 \ Figs jpg \ Fig1.jpg图1 。多核糖体分析概述。一。细胞，组织或整个动物裂解液的超速离心可将游离的核糖核蛋白复合物（RNP）从与40S（蓝色），60S（红色）和80S单核小体（黄色）和多核糖体（绿色）结合的RNA中分离出来。B. RNA吸光度测量和分馏来分离游离的mRNA和mRNA结合到monosomes 和多核糖体。 D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902828--1508 Jarod Rollins 810785 \ Figs jpg \ Fig2.jpg图2 。协议概述。该协议首先准备了将蠕虫裂解液上样的蔗糖梯度。裂解物的超速离心使多核糖从RNA沉淀远离RNA不被多核糖体结合的。在离心过程中，可以通过冲洗管线并盖上流通池来准备梯度站。将离心的梯度加载到工作站中，以读取RNA吸光度和蛋白质荧光（可选）。将所得的级分冷冻以用于后续处理。可以分析多核糖体概况，以了解多核糖体曲线下面积的变化。