Biofilm formation, stress responses and virulence genes diversity in Listeria monocytogenes

Ο μικροοργανισμός Listeria monocytogenes είναι ένα ιδιαίτερα πολύπλευρο βακτήριο, ικανό να ενυπάρχει ως σαπρόφυτο στο περιβάλλον και ως ενδοκυττάριο παθογόνο μέσα σε ξενιστή. Αποτελεί αιτία της τροφιμογενούς λοίμωξης «λιστερίαση», που είναι μια σοβαρή ασθένεια με υψηλής σημασίας επιπτώσεις στην υγεία, αλλά και στην οικονομία. Κατά τη διάρκεια της σαπροφυτικής του μορφής ζωής, αποικεί σε βιοτικές και αβιοτικές επιφάνειες, σχηματίζοντας βιοϋμένια, ενώ ως παθογόνο μέσα σε ξενιστή, επιδεικνύει διάφορα επίπεδα λοιμωξιογόνου δράσης. Η ευρεία διάδοση του παθογόνου στο περιβάλλον, το καθιστά ικανό να επιμολύνει φρέσκα φυτικά προϊόντα σε οποιαδήποτε φάση της καλλιέργειας, συγκομιδής ή επεξεργασίας τους. Κατά τη φύλαξη των φυτικών προϊόντων σε χαμηλές θερμοκρασίες, το παθογόνο αντιμετωπίζει αντίξοες συνθήκες που πιθανόν να επηρεάσουν τη φυσιολογία του.Η παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε με τους εξης στόχους: (α’) την εξέταση της προσαρμοστικής συμπεριφοράς του παθογόνου σε φρέσκα φυτικά προϊόντα, όπως αυτή εκφράζεται κατά την μετέπειτα απόκριση του παθογόνου σε συνθήκες καταπόνησης που σχετίζονται με την επεξεργασία τροφίμων (ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2), (β’) τη διερεύνηση της συσχέτισης μεταξύ σχηματισμού βιοϋμενίων και απόκρισης σε αντιμικροβιακές ουσίες, όπως αυτή παραλάσσει μεταξύ διαφορετικών στελεχών και αβιοτικών επιφανειών (ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3), και (γ’) τη μελέτη της διαστελεχιακής παραλλακτικότητας στο σύμπλεγμα γονιδίων παθογένειας prfA, όπως αυτή διαμορφώνεται μεταξύ στελεχών διαφορετικών οροτύπων (1/2a και 4b), διαφορετικής γεωγραφικής προέλευσης, (Αυστραλία, Ελλάδα, Ιρλανδία), και διαφορετικής πηγής απομόνωσης (τρόφιμα ή κλινικές περιπτώσεις) (ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4). Τα αποτελέσματα του Κεφαλαίου 2 έδειξαν ότι, το ενδιαίτημα στο οποίο προϋπήρξε το παθογόνο, όπως είναι το φρέσκο φυτικό προϊόν σε χαμηλές θερμοκρασίες φύλαξης, μπορεί να προστατεύσει τα κύτταρα κατά τη μετέπειτα υποβολή τους σε αντιμικροβιακούς χειρισμούς, αυξάνοντας με αυτόν τον τρόπο τον κίνδυνο για την ασφάλεια των τροφίμων. Οι μεταβολές αυτές είναι σε άμεση συσχέτιση με το είδος του φυτικού προϊόντος και τη διάρκεια προσαρμογής τους σε αυτό. Στα κύτταρα που επωάστηκαν πάνω σε τοματίνια, ενισχύθηκε η ικανότητά τους να ανθίστανται σε παρεμποδιστικά επίπεδα ωσμωτικής ή όξινης καταπόνησης, σε σχέση με αυτά που επωάστηκαν επάνω σε επιφάνειες μαρουλιού (P < 0.05). Αντίθετα, υψηλότερη θερμοανθεκτικότητα κυττάρων παρατηρήθηκε μετά την επώασή τους πάνω σε μαρούλι. Η παρατεταμένη επώση σε χαμηλές θερμοκρασίες (δηλ., 5 ημέρες έναντι 24 ωρών), ενίσχυσε την ανθεκτικότητα σε όξινη και ωσμωτική καταπόνηση, σε αντίθεση με το θερμική καταπόνηση, στην οποία τα κύτταρα παρουσίασαν μεγαλύτερη ευαισθητοποίηση.Τα αποτελέσματα του Κεφαλαίου 3 έδειξαν ότι, διαφορετικά στελέχη του παθογόνου παράγουν στατιστικώς σημαντικά διαφορετικά επίπεδα βιοϋμενίων, τα οποία βρίσκονται σε άμεση συσχέτιση με το είδος της αβιοτικής επιφάνειας που αποικούν. Επιφάνειες πολυστυρενίου ήταν πιο επιρρεπείς σε αυτή την εποίκιση από κύτταρα του παθογόνου (P = 0.002) σε σχέση με τον ανοξείδωτο χάλυβα. Τα σχηματισθέντα βιοϋμένια επέδειξαν μεγαλύτερη ανθεκτικότητα σε βακτηριοκτόνες ουσίες από τα αντίστοιχα του ανοιξείδωτου χάλυβα (P = 0.0003). Η ενδογενής ανεκτικότητα των στελεχών L. monocytogenes σε ουσίες τεταρτοταγούς αμμωνιίου (QACs), ήταν ανάλογη της ικανότητάς τους να αποικούν σε επιφάνειες ανοξείδωτου χάλυβα (P = 0.03). Η ενδογενής ανεκτικότητα των κυττάρων και η ανθεκτικότητα των βιοϋμενίων σε διάλυμα υπεροξικού οξέος, διέφεραν μεταξύ των στελεχών έως και κατά 24 φορές, και η συσχέτιση μεταξύ αυτών των παραμέτρων ήταν θετική (P = 0.02). Στο Κεφάλαιο 4, η γονοτύπηση του pVGC σε 36 στελέχη L. monocytogenes έδειξε ότι, η γεωγραφική διασπορά των στελεχών μπορεί να επάγει προσαρμοστικούς μηχανισμούς που θα επιδράσουν στον πολυμορφισμό των γονιδίων, απαραίτητων για την λοιμωξιογόνο δράση του βακτηρίου. Στελέχη απομονωμένα στην Ιρλανδία με ορότυπο 4b είχαν διαφορετικούς τύπους γονιδίου hly από στελέχη απομονωμένα στην Αυστραλία ή την Ελλάδα. Επιπλέον, στελέχη από την Αυστραλία είχαν μικρότερη ποικιλομορφία σε σχέση με τα στελέχη Ελλάδας και Ιρλανδίας στα γονίδιο plcB και mpl. Σχετικά με την πηγή απομόνωσης, η διαφορετικότητα μεταξύ στελεχών προερχόμενων από περιβάλλοντα τροφίμων και από κλινικές περιπτώσεις ήταν εμφανής στα γονίδια prfA, actA και plcB, με τις δυο ομάδες στελεχών να δείχνουν διαφορετικά μονοπάτια εξέλιξης. Τα πιο συντηρημένα γονίδια του συμπλέγματος ήταν το prfA και το hly, ενώ το πιο ποικιλόμορφο ήταν το actA, υποδεικνύοντας πιθανόν νέους ρόλους για το ActA και την αναγκαιότητα συντήρησης των prfA και hly. Η ομαδοποίηση κατά ορότυπο, αποτέλεσε μια καλά δομημένη ομάδα σε σχέση με τις άλλες, (δηλ. με βάση τη γεωγραφική προέλευση ή την πηγή απομόνωσης), με μεγαλύτερη ποικιλομορφία σε στελέχη ορότυπου 1/2a από ό,τι στον ορότυπο 4b.Συνολικά, τα αποτελέσματα της διατριβής είναι ενδεικτικά της προσαρμοστικής φύσης του L. monocytogenes, η οποία του παρέχει έναν αξιόλογο αριθμό πλεονεκτημάτων επιβίωσης σε διάφορα περιβάλλοντα και διαμορφώνει την εξελικτική του πορεία. Τα γονίδια μολυσματικότητας φαίνεται να διαμορφώνονται με βάση το περιβάλλον διαβίωσης, με συνέπεια τη διαφοροποίηση μεταξύ στελεχών στα επίπεδα λοιμωξιογόνου δράσης τους, και την επιδημιολογική κυριαρχία συγκεκριμένων ομάδων στελεχών έναντι άλλων.