Cell-free Synthesis of Correctly Folded Proteins with Multiple Disulphide Bonds: Production of Fungal Hydrophobins

Cell-free synthesis is a powerful technique that uses the transcriptional and translational machinery extracted from cells to create proteins without the constraints of living cells. Here, we report a cell-free protein production protocol using Escherichia coli lysate (Figure 1) to successfully express a class of proteins (known as hydrophobins) with multiple intramolecular disulphide bonds which are typically difficult to express in a soluble and folded state in the reducing environments found inside a cell. In some cases, the inclusion of a recombinant disulphide isomerase DsbC further enhances the expression levels of correctly folded hydrophobins. Using this protocol, we can achieve milligram levels of protein expression per ml of reaction. While our target proteins are the fungal hydrophobins, it is likely that this protocol with some minor variations can be used to express other proteins with multiple intramolecular disulphide bonds in a natively folded state.Graphic abstract:Figure 1. Workflow for cell-free protein expression and single-step purification using affinity chromatography. A. E. coli S30 lysate prepared as described in Apponyi et al. (2008) can be stored for up to several years at -80°C without any loss of activity in our experience. B. The S30 lysate, plasmid DNA that encodes for the protein of interest along with an affinity tag and components required for transcription and translation are added to the reaction mix. Following a single-step protein purification, the protein of interest can be isolated for further use., [摘要]无细胞合成是一项强大的技术，它利用从细胞中提取的转录和翻译机制来创建蛋白质，而不受活细胞的限制。在这里，我们报告了使用大肠杆菌裂解物（图1）成功表达一种具有多个分子内二硫键的蛋白（称为疏水蛋白）的无细胞蛋白生产方案，这些蛋白通常很难在可溶性和折叠状态下表达。减少细胞内发现的环境。在某些情况下，包含重组二硫键异构酶DsbC可以进一步提高表达水平正确折叠的疏水蛋白。使用此协议，我们可以达到每毫升反应毫克表达的蛋白质水平。虽然我们的目标蛋白是真菌疏水蛋白，但该方案可能会有一些细微的变化，可用于以天然折叠状态表达具有多个分子内二硫键的其他蛋白。图形摘要：图1.使用亲和色谱法进行无细胞蛋白质表达和一步纯化的工作流程。一。如Apponyi等人所述制备大肠杆菌S30裂解物。（2008 ）可以在-80的温度下存储长达几年 °C，根据我们的经验，没有任何活动损失。乙。在S30裂解物，质粒DNA，对与亲和标签沿着感兴趣的蛋白进行编码和转录和翻译必需的组件加编到反应混合物中。一步纯化蛋白质后，可以分离目标蛋白质以进一步使用。[背景]细菌胞浆微环境是家庭对成千上万不同的反应，并且是在还原严格调控氧化还原状态。这对重组细菌蛋白质的过表达提出了挑战，因为还原环境可以阻止在需要它们的结构和/或功能的蛋白质中正确形成关键的二硫键（Kadokura和Beckwith，2010）。因此，这些蛋白质通常表示由大肠杆菌成不溶性包涵体（Berkmen，2012）该呈现它们不可用。在有利的情况下，从包涵体中的蛋白质可复性在体外后solubili小号ING在强烈的变性剂（秦等人，2015年）。然而，这通常是一个漫长且耗费试剂的过程，并且正确重折叠的蛋白质的产量是可变的。常规重组细菌过表达的一种替代方法是无细胞合成，其中可以使用细菌转录和蛋白质生产机制表达蛋白质，但没有细胞的限制（Apponyi等，2008 ; Ozawa和Loh，2014 ; Gao等。等，2019；Dondapati，2020 ）。无细胞方案对于表达富含半胱氨酸的蛋白质特别有用，因为可以通过简单地改变还原型和氧化型谷胱甘肽（GSH：GSSG）的比例以及改变还原剂（如二硫苏糖醇（DTT））的浓度来控制氧化还原环境。）。后优化，以正确地形成蛋白质的产量二硫化物键适于下游实验（例如，结合研究，结构和生物物理表征）可以大大增加。除具有二硫键的蛋白质外，无细胞蛋白质合成系统与传统的重组蛋白质生产相比，还具有其他优势，例如能够轻易掺入非天然氨基酸（Gao等人，2019 ；Dondapati等人，2020）。此外，太毒了宿主细胞蛋白可以在无细胞环境中表达，因为没有需求来维持细胞活力，这也使得高通量生产和筛选膜蛋白，酶和其他疗法 （Khambhati et al。，2019）。我们优化的无细胞表达方案允许直接控制反应混合物中的氧化还原条件，并显示出优于重组表达的一类称为真菌疏水蛋白的蛋白质的明显优势（Siddiquee等，2020）。这类蛋白质的特征在于四个二硫键，疏水蛋白在亲水：疏水界面自组装成两亲性层需要正确的键合模式（Sunde等，2008 ；Ball等，2020）。第ESE独特assembl IES公顷VE建议的范围内的药物递送系统的生物技术应用到涂覆植入物和所述表面中的工程以提高生物相容性（Wosten和Scholtmeijer，2015 ;伯杰和Sallada，2019） 。W¯¯往往微不足道许多疏水蛋白可以在过表达大肠杆菌到一个非常高的收益率，蛋白质几乎只发现错误折叠的包涵体内，而不能用于下游应用。因此，通常需要很长的体外重折叠和多步纯化过程才能从部分折叠和错误折叠的物种中分离正确折叠的蛋白质（Kwan等人，2006； Pille等人，2015 ；Pham等人， 2016）。为了克服这个问题，我们已经制定了一个无细胞表达系统疏水蛋白的生产基础上的发布S30大肠杆菌裂解液（Apponyi等，2008） 。S30裂解物是无细胞蛋白质合成中最常用的提取物之一，含有细胞转录和翻译机制。使用“ S30无细胞”作为搜索词的Pubmed搜索可得到150篇以上的文章。虽然S30裂解物可以商购（例如，来自Promega），它可以容易地制造在执行重组蛋白质表达和纯化实验室在成本的一小部分的可商购的无细胞表达的试剂盒。此无细胞反应包括温育裂解物和其它关键辅因子与所关注的基因克隆到透析秒的组成型启动子的下游，等起来。设置透析允许较低的分子的试剂（发生连续交换例如，氨基酸，的rNTPs ，ATP），并提供每单位更高的蛋白产量组分是更昂贵或费时的来制备（例如，在转录和翻译机器S30提取物以及质粒DNA ）。为了帮助纯化，我们将该基因克隆到了具有六组氨酸亲和标签但缺乏lac操纵子的载体pET -MCSIII中（Neylon等，2000 ）。本文介绍的方案可以轻松修改，以表达具有二硫键的其他蛋白质。该协议中使用的设备可以使用大多数科学实验室中常用的一次性塑料管轻松制备，并且可以根据需要进行放大。的效率和低成本这组向上允许多个蛋白质（例如，蛋白质和其突变体）以被并行无细胞反应使用一种生产制备的透析缓冲液中。同位素标记的蛋白还可以容易地通过替代衔接产生纳克在标记的氨基酸在该反应混合物中。我Ñ一些情况下小号，这已经允许核磁共振（NMR）和质谱实验的目的蛋白上的一天内进行设定的反应而不需要进一步纯化。