Cryopreservation of Passiflora suberosa L. shoot tips using the V cryo-plate technique and evaluation of cryoinjuries in the cell membranes

Passiflora suberosa L., conhecida como maracujá-mirim ou maracujazinho-cortiçapreto, é uma espécie nativa que ocorre desde o Nordeste até o Sul do Brasil. Embora apresente grande potencial agronômico, ornamental e medicinal, poucos estudos biotecnológicos foram desenvolvidos para essa espécie, visando à propagação e à conservação in vitro. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de um protocolo de criopreservação para ápices caulinares de P. suberosa utilizando a técnica de V-Crioplaca, incluindo a avaliação da influência do tempo de cultura da fonte de explantes e do tipo e período de exposição às soluções de vitrificação PVS2 (0°C) e PVS3 (25°C). Além disso, a avaliação de danos nas membranas celulares foi também investigada pela quantificação do malondialdeído (MDA), um subproduto da peroxidação de fosfolipídios. Para avaliar a influência do tempo de cultura da fonte de explantes na recuperação pós-resfriamento, ápices caulinares foram excisados de microestacas produzidas a partir da cultura de segmentos nodais em meio MSM ½ após 20, 30 ou 40 dias. Após esses períodos, os explantes foram précultivados na presença de sacarose a 0,3 M, por 24 horas e então transferidos para placas de alumínio, onde foram expostos à solução de loading e às soluções de vitrificação PVS2 ou PVS3, por diferentes períodos (0, 30, 45, 60, 90, 120, 150 minutos), antes da imersão em nitrogênio líquido. As taxas de sobrevivência e a recuperação foram avaliadas 30 e 60 dias após o reaquecimento e a transferência do material para meio de recuperação, respectivamente. A recuperação de plantas a partir de ápices criopreservados ocorreu em frequências distintas, dependendo do tempo de cultura da fonte de explante e do tempo de exposição à solução crioprotetora. As maiores taxas de recuperação foram observadas a partir de ápices caulinares excisados de microestacas mantidas em cultura por 20 dias e expostos à PVS2 por 90 minutos (50 %), e a partir de explantes excisados de microestacas com 40 dias e expostos à PVS3 por 45 a 90 minutos (50 a 60 %). No entanto, a produção de brotos ocorreu de forma mais rápida nos ápices expostos a PVS3. Foi também observada a formação de calos friáveis na base dos explantes expostos a ambas soluções crioprotetoras. O conteúdo de MDA foi maior após a desidratação osmótica do material, quando comparado com o observado nas amostras controle e no material criopreservado e armazenado por 24 horas no escuro após o reaquecimento. Esses resultados demonstraram que a técnica de V-Crioplaca foi eficiente para a criopreservação de ápices caulinares de P. suberosa, tendo sido influenciada pelo tempo de cultura da fonte de explantes e pelo tempo de exposição e o tipo de solução crioprotetora utilizada. A investigação das injúrias ocorridas nas membranas celulares durante o processo de criopreservação permitiu a identificação preliminar de uma etapa crítica do protocolo. Esses resultados indicam a necessidade de uma ampla investigação das alterações morfofisiológicas induzidas pela criopreservação, visando à otimização do protocolo aqui estabelecido para o aumento das taxas de recuperação de plantas pós-resfriamento em NL.