Functional and structural studies of AKR1B15 and AKR1B16: Two novel additions to human and mouse aldo-keto reductase superfamily

La superfamilia de les aldo-ceto reductases (AKR) compren un gran nombre de proteines monomeriques de localitzacio citosolica d'un un pes molecular d'aproximadament 36 kDa. Les AKRs tenen un plegament proteic comu evolutivament conservat, que consisteix en un barril (α/β)8. La majoria d'AKRs actuen reduint aldehids i cetones als seus respectius alcohols en una reaccio dependent de NADPH, amb un ampli espectre de substrats que va des de sucres simples fins a aldehids potencialment toxics. Aquesta Tesi s'emmarca dins l'estudi estructural i funcional de les AKR realitzat pel nostre grup, especialment la seva contribucio dins la via de biosintesi de l'acid retinoic (RA). El nostre grup va descriure activitat retinaldehid reductasa en la familia AKR i des de llavors ha estat involucrat en l'estudi funcional i estructural de les AKR humanes en relacio amb aquest important paper fisiologic. El grup va obtenir l'estructura cristal·lografica d'AKR1B10, un enzim sobre-expressat en cancer. Es va proposar una relacio entre l'alta activitat retinaldehid reductasa de l'enzim i el desenvolupament del cancer. La primera part d'aquesta Tesi esta basada en la purificacio i caracteritzacio d'un nou enzim AKR huma; AKR1B15, amb un 92% d'identitat sequencial amb AKR1B10. La proteina recombinant precipitava en cossos d'inclusio al purificar-se, mostrant activitat limitada quan era solubilitzada amb detergents. Gran part del material solubilitzat estava en forma d'agregats d'alt pes molecular sense activitat. Vam desenvolupar una aproximacio nova en AKRs, utilitzant un sistema de coexpressio amb xaperones, incrementant aixi la forma soluble i monomerica de la proteina. L'activitat enzimatica va ser caracteritzada amb un ampli rang de substrats tipics d'AKR. AKR1B15 mostra valors de Kcat i de Km mes baixos que AKR1B10, excepte per cetones i α-dicarbonils. Encara mes, mostra una eficiencia catalitica superior envers el 9-cis-retinaldehid que no pas AKR1B10, trobant-se entre les 9-cis-retinaldehid reductases mes eficients de les AKR. Estudis d'inhibicio han mostrat que l'enzim te una selectivitat pels inhibidors mes restrictiva que no AKR1B10 o AKR1B1, i diversos inhibidors coneguts d'aldosa reductasa (ARI) no l'inhibeixen. Es va construir un model estructural per analitzar les diferencies en el lloc d'unio a substrat d'AKR1B15. Els canvis de residus localitzats en els llacos A i C donen lloc a centre actiu mes petit, hidrofobic i rigid d'AKR1B15 comparat amb AKR1B10, cosa que explica la diferent especificitat de substrat i diferent selectivitat d'inhibidors. Es va fer un estudi cel·lular de l'activitat retinaldehid reductasa per transfeccio transitoria d'AKR1B15 i AKR1B10 utilitzant cel·lules HEK293T com a model. Es va observar que AKR1B10, pero no AKR1B15, participava en la reduccio del retinaldehid i provocava canvis en els nivells cel·lulars d'acid retinoic. La segona part d'aquesta Tesi s'ha centrat en les diferencies estructurals de les butxaques d'unio d'AKR1B15 i AKR1B10 i la diferent funcio dels dos enzims. Mutants d'AKR1B10 van ser preparats intentant mimetitzar la butxaca catalitica d'AKR1B15, amb l'objectiu de convertir aquest enzim en l'altre, i comprendre quins son els factors que determinen la diferent selectivitat dels dos enzims. Els mutants van mostrar valors de kcat i de Km mes elevats que els enzims salvatges, amb caracteristiques que els assemblaven a AKR1B15, com l'activitat front cetones i la seva habilitat per reduir eficientment el 9-cis-retinal. Finalment, es va realitzar la caracteritzacio d'un nou enzim de ratoli, AKR1B16. Estudis previs havien determinat que AKR1B16 era una proteina activa expressada en teixits. En aquesta Tesis s'ha realitzar una analisi filogenetica, una caracteritzacio cinetica i s'ha determinat la seva activitat amb retinoides. L'enzim va mostrat activitat moderada amb tots els substrats analitzats, amb activitat baixa front retinaldehid. Els resultats porten a la conclusio que AKR1B16 no es una proteina ortologa d'AKR1B10 o cap altra AKR1B humana.