Contrôle génétique de la croissance et des conditions de culture pour maximiser la production biotechnologique chez E. coli

Plusieurs verrous techniques limitent les performances de la production de molécules d’intérêt par des microorganismes, que ce soit en termes de rendement ou de productivité. L’un d’eux concerne l’allocation des ressources cellulaires entre le métabolisme endogène de l’organisme et les voies métaboliques pour la synthèse d’un composé d’intérêt. Pour pallier ce problème, une solution consiste à découpler l’accumulation de biomasse et la synthèse du produit, permettant de focaliser les ressources à une fonction à la fois. Un autre verrou concerne la stabilité des souches modifiées qui ont tendance à muter pour se débarrasser des fonctions ajoutées par ingénierie génétique. Enfin, il serait souhaitable de parvenir à des systèmes de culture flexible et continue pour maximiser les performances de bioproduction.Cette thèse s’intéresse à ces différentes problématiques à travers le développement de souches d'Escherichia coli dans lesquelles le taux de croissance peut être modulé. Le contrôle de la croissance est assuré via un commutateur synthétique de la croissance au niveau génique. Plus spécifiquement, le commutateur se traduit par la mise sous le contrôle de promoteurs inductibles des gènes codant pour les sous-unités de l’ARN polymérase.Une partie de nos travaux a été dédiée à l’amélioration de la stabilité d’une souche où le promoteur des gènes rpoB, et rpoC, codant respectivement pour les sous-unités beta, et beta’, est inductible à l’IPTG. Notre stratégie a reposé sur la redondance génétique du contrôle en ajoutant le gène rpoA, codant pour la sous-unité alpha, également sous contrôle d’un promoteur inductible à l’IPTG. En inhibant l’expression de ces gènes, la croissance des bactéries est stoppée au bénéfice d’un rendement, proche du maximum théorique, de notre métabolite modèle, le glycérol. Par ailleurs, la stratégie de redondance du contrôle sur l’opéron rpoBC et le gène rpoA a conduit à une amélioration significative de la stabilité de la souche.Nous nous sommes également intéressés à des stratégies d’induction plus flexibles et dynamiques pour alterner des phases de croissance avec des phases de biosynthèse. Une première approche a concerné l’induction chimique avec le lactose, métabolisable naturellement par E.coli contrairement à l’IPTG. Au travers d’essais de cultures en bioréacteurs en chemostat au cours desquels nous avons alterné la source de carbone, entre le glucose et le lactose, nous sommes parvenus à alterner des phases d’accumulation de biomasse et d’inhibition de la croissance sur une dizaine de jours.Une autre stratégie d’induction à laquelle nous nous sommes intéressés repose sur l’optogénétique, qui permet d’induire l’expression de gènes par de la lumière. Nos travaux ont porté sur le clonage et l’optimisation du système optogénétique CcaR/CcaS chez E.coli. Plus spécifiquement, nous avons recherché quels profils d’expression pour les gènes ccaR et ccaS permettrait d’atteindre une gamme dynamique d’induction propice à un commutateur de la croissance. Pour cela, nous avons généré et cloner une librairie de promoteurs pour les gènes ccaR et ccaS. Cette librairie a ensuite été criblée selon deux méthodes : l’une en mettant un gène rapporteur d’une protéine fluorescente sous le contrôle du système optogénétique, et l’autre basée sur la croissance en mettant sous contrôle optogénétique les gènes rpoB et rpoC.L'induction flexible et dynamique de la croissance offrent des possibilités intéressantes à explorer en matière de schéma d'induction. Cela ouvre également des perspectives d'application de bioproduction couplée à la cybergénétique où les comportement de la culture est analysée en temps réel pour moduler l'induction et optimiser à la fois la formation de biomasse et la synthèse de produit d'intérêt.