基于磁珠和双抗夹心免疫分析的 Bt Cry1Ac 毒素单链抗体筛选与鉴定

【目的】通过设计并优化生物素一亲和素标记磁珠筛选策略，建立针对CrylAc毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法，为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法，经过4轮筛选后，对每轮筛选后抗CrylAc毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定，通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Crylhc的阳性克隆，并对其进行PCR鉴定和DNA测序，确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。利用纯化后的scFv-A12作为“捕获抗体”，Anti-CrylAc兔多克隆抗体作为“检测抗体”，建立针对CrylAc的双抗夹心ELISA检测方法。【结果】以生物素化的CrylAc蛋白为包被原，利用噬菌体抗体库对其进行了4轮液相筛选。结果显示，相对产出率随着筛选轮数的增加而提高，第4轮较第1轮提高了42倍；单克隆噬菌体ELIsA鉴定抗CrylAc噬菌体抗体，以试验孔OD450／阴性孔OD450大于2．1为阳性标准，从第4轮筛选后的培养皿中随机挑选了300个菌落，经单克隆ELISA鉴定出6个阳性克隆，分别命名为hsCrylAc-C5、hsCrylAc-D8、hsCrylAc-Cl2、hsCrylAc-A12、hsCrylAc-F9和hsCrylAc-F4。其中，hsCrylAc-A12具有相对较高的亲和力。对上述6个阳性克隆进行菌液PCR检测发现，在935bp处均有明显的目的条带，通过对其进行测序和氨基酸序列比对，最终得到4株不同氨基酸序列的阳性克隆。hsCrylAc-A12在成功替换宿主菌HB2151后，经1mm01·L-1 IPTG诱导表达，于30℃条件下培养过夜。其表达产物经HiSTrapHP镍亲和柱纯化后SDS-PAGE检测，hsCrylAc-A12蛋白分子量约为30kD。通过方阵滴定对抗体浓度进行优化后，利用单链抗体为“捕获抗体”，多抗为“检测抗体”，建立了CrylAc双抗�