东北七鳃鳗 NF-κB 基因启动子的构建及活性

核转录因子NF-κB (nuclear factor kappa B)对机体的免疫反应、炎症反应等起重要的调控作用。为了获得NF-κB基因启动子的活性报告基因，进一步研究原始脊椎动物免疫应答的机制，实验根据此前克隆得到的东北七鳃鳗NF-κB基因的编码序列(coding sequence，CDS)，以与东北七鳃鳗高度同源的日本七鳃鳗同源基因5′上游启动子特征序列为模板设计引物，克隆获得了东北七鳃鳗NF-κB启动子序列，该序列全长3 169 bp，提交至NCBI数据库GenBank获得登录号MN368861。经AliBaba 2.1软件预测该序列包含CREB (cgtgacttca)、Oct-1 (aatatgaatt)、GATA-1 (gaacctatct)、AP-1 (ggttgagtca)、NF-kappa B (ctttcctgtt)、IRF-1 (tttcctgttc)、Sp-1 (tgtgaggggt)、c-Jun (acgtgacttc)和c-Fos (ggttgagtca)等多个转录因子结合位点，并包含TATA box转录核心元件。通过MethPrimer软件预测在序列1 207~1 402 bp处存在CG含量大于50%，长196 bp的CpG岛。利用双酶切技术构建了pGL3-NF-κB-pro重组质粒，并将其转染至人胚肾细胞(human embryonal kidney, HEK293T)和鲤上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid, EPC)中。双荧光素酶报告基因系统检测结果显示，该片段序列在哺乳动物细胞和鱼类细胞中均具有启动子活性，同时在HEK293T中经过Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)的配体LPS刺激后，启动子活性显著上升。本研究成功构建了东北七鳃鳗NF-κB启动子报告基因，并在不同细胞中证实了其活性。LPS刺激后的检测结果揭示东北七鳃鳗NF-κB参与了TLR信号通路的免疫应答。东北七鳃鳗NF-κB报告基因的构建为探究原始脊椎动物免疫系统信号传导机制奠定了基础。