Optimierung eines Expressionssystems für die Synthese von Redox- und Membranproteinen in Rhodobacter capsulatus

Die Synthese von Proteinen mit Metall-Kofaktoren oder Membranproteinen mittels heterologer Expression ist in bakteriellen Expressionssystemen oft durch die physiologischen Eigenschaften der Expressions¬wirte limitiert. Um die Expression solcher Zielproteine dennoch zu ermoglichen, konnen Standartexpressionswirte, wie z.B. das Enterobakterium Escherichia coli genetisch modifiziert werden. In vielen Fallen stellt jedoch die Verwendung alternativer Expressionswirte grundsatzlich eine interessante Option dar. So scheinen z.B. phototrophe Bakterien, wie Rhodobacter capsulatus, aufgrund ihrer besonderen physiologischen Eigenschaften fur die funktionelle Expression von Membranproteinen und Proteinen mit Metall-Kofaktor im besonderen Mase geeignet zu sein: Die phototrophe Anzucht von R. capsulatus geht mit der Ausbildung eines intracytoplasmatischen Membransystems (ICM) einher, wobei zudem effiziente Faltungs- und Integrationssysteme fur Membranproteine zur Verfugung stehen. R. capsulatus generiert als phototropher und Stickstoff-fixierender Organismus auserdem eine Reihe von Redox-Kofaktoren, sodass auch die Synthese von Proteinen mit solchen Kofaktoren begunstigt ist. Im Rahmen der Arbeit wurde daher zunachst untersucht, inwieweit die Verwendung von LEDs, die ausschlieslich im physiologisch relevanten Wellenlangenbereich Licht emittieren, die phototrophe Anzucht von R. capsulatus, sowie die Synthese der Photosynthesemembran und der Kofaktoren beeinflusst. Durch die Belichtung mit Infrarotdioden wurde zunachst ausschlieslich das Bakteriochlorophyll des Photosystems angeregt, was zu verkurzten Generationszeiten, erhohter Proteinbiosynthese und vermehrter Ausbildung von Metall¬-Kofaktoren fuhrte. Bei der Verwendung von Blaulichtdioden (Anregung der Carotinoide des Photosystems), zeigte sich hingegen uberraschend ein Phanotyp der vermutlich durch Lichtmangel induziert wird. Zunachst wurden bei diesen Lichtbedingungen das Wachstum und die Proteinbiosynthese beeintrachtigt. Daruber hinaus zeigte sich jedoch, dass R. capsulatus bei Blaulicht eine deutlich erhohte Menge an Photopigmenten bildete, was ein Indikator fur die erhohte ICM-Synthese ist. Es ist dementsprechend moglich, bei der phototrophen Anzucht von R. capsulatus durch die Wahl der Lichtquellen physiologische Veranderungen herbeizufuhren, die der funktionellen Synthese bestimmter Zielproteine, wie etwa Membranproteinen dienlich sind. Zur naheren Charakterisierung der Licht-abhangigen Phanotpypen wurde eine Mutante von R. capulatus erzeugt, die das photoactive yellow protein, dem einzigen bekannten Blaulichtrezeptor in R. capsulatus, nicht mehr ausbilden kann. Bei dem Vergleich des R. capsulatus Wildtyps mit der pyp-Mutante unter Infrarot- und Blaulichtbeleuchtung, konnte erstmals gezeigt werden, dass die Expression der Photosynthese- und Nitrogenasegene in Abhangigkeit von PYP reguliert ist. Weiterhin wurden die schon bestehenden R. capsulatus pRho-Expressionsvektoren so optimiert, dass sie fur die Reinigung von Membranproteinen und Proteinen mit Metall-Kofaktoren besser geeignet sind. Dazu wurde zum einen der R. capsulatus Pnif Promotor in den Rhodobacter-Expressionsvektor kloniert. Dieser Promotor erlaubt die Koinduktion der heterolgen Genexpression mit der Ausbildung des ICM und der Eisen-Schwefel-Kofaktoren. Daruber hinaus wurde der His6 Affinitatstag durch den Strep II Affinitatstag ersetzt, um die Metallbindungseigenschaften rekombinanter Metalloproteine nicht zu beeinflussen. Die Expressionsstarke und Regulierbarkeit des Promotors Pnif wurden zunachst durch die Expression des Fluoreszenzreporters YFP getestet. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Promotor Pnif durch Ammonium und uberraschender Weise auch durch Blaulicht strikt inhibiert werden kann. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sich die Expressionsstarke durch eine einfache Anderung der Strahlungsintensitat im infraroten Bereich moduliert werden kann. Diese Expressionsvektoren wurden anschliesend zur Uberexpression des Ferredoxins FdII, einem Redoxprotein mit einem [3Fe-4S] und einem [4Fe-4S] Eisen-Schwefel Kofaktor in R. capsulatus eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass R. capsulatus im Gegensatz zu E. coli in der Lage ist, dieses Protein mit den entsprechenden Metall-Kofaktoren zu synthetisieren.