Diseño y evaluación de inhibidores peptídicos dirigidos a la interfaz de dimerización de la tripanotión reductasa de Leishmania Infantum

espanolEntre las muchas peculiaridades que se encuentran al estudiar los organismos tripanosomatidos de interes clinico, una de las mas interesantes desde el punto de vista de la identificacion de nuevas dianas terapeuticas es la forma como este parasito destoxifica su ambiente intracelular de especies oxidantes. Al carecer del ubicuo sistema glutation/glutation reductasa, en su lugar, el parasito cuenta con un sistema analogo modificado que emplea el tripanotion (T[SH]2), que no es mas que dos moleculas de glutation unidas por un puente espermidina. Esta union permite que los tioles activos de la molecula se encuentren en mas proximidad haciendola mejor reductor que el glutation. En el centro del metabolismo del T(SH)2 se encuentra la tripanotion reductasa (TryR), una enzima esencial para la supervivencia del parasito que esta encargada de mantener en todo momento un pool de tripanotion reducido dentro de la celula. Esta enzima es un homodimero que cuenta con dos centros activos en los que participan residuos de ambas subunidades, haciendo de su configuracion dimerica una caracteristica fundamental para su actividad. Al sintetizar un peptido que emula una de las helices ? que hacen parte de la interfaz de dimerizacion ubicada donde ambas subunidades hacen contacto, hemos sido capaces de desestabilizar el dimero de la enzima y minimizar su actividad. Se han desarrollado distintas variantes de este peptido con el fin de mejorar su estabilidad y potenciar su actividad. Entre las modificaciones realizadas se encuentran (1) la sustitucion por alanina de cada uno de sus aminoacidos para evaluar su relevancia, (2) el acortamiento del peptido para determinar la secuencia minima que conserva la actividad deseada y (3) la creacion de peptidos estructuralmente restringidos en los que se intentan mantener las caracteristicas estructurales de la helice original. A partir de las exploraciones realizadas se obtuvieron dos peptidos especialmente relevantes: TRL35, (Ac-PKIIQSVGISNLEKNLE-NH2) y TRL38 (Ac-PKIIQSVGI-NH2), de 13 y 9 aminoacidos, respectivamente. Ademas, basandonos en las interacciones que se dan entre la enzima y el peptido corto deducidas de las simulaciones de dinamica molecular, se desarrollo un modelo farmacoforico que permitio la identificacion de moleculas pequenas con capacidad de inhibir la actividad enzimatica. Para finalizar, hemos caracterizado bioquimicamente la interaccion entre TRL35 y TryR, logrando identificar el modelo mediante el cual se da esta inhibicion y las implicaciones de esta en la estabilidad de la estructura globular de la enzima. EnglishThe pharmacological treatment of Leishmaniasis still leaves much to be desired in terms of efficacy and effort devoted to the development of new agents. In the search for novel molecular entities, it is always preferable to focus on targets that are absent in the human host. Leishmania parasites lack the ubiquitous glutathione/glutathione reductase system (GSH/GluR) that is used in most prokaryotic and eukaryotic cells to detoxify their intracellular milieu from the damaging oxidizing agents produced during metabolism. Instead, they make use of the rather unique trypanothione/trypanothione reductase (T(SH)2/TryR) system, the blockage of which can be used to impair parasite survival. T(SH)2 is formed by two glutathione molecules bound together by a spermidine bridge. This molecule is so effective (more than glutathione) as an antioxidant that Leishmania relies solely on this system to withstand the harsh oxidant environment found inside of the phagolysosome. TryR is a homodimeric enzyme with C2 symmetry and two independent catalytic sites, each of which is made up of residues belonging to both monomers. Therefore, the dimeric configuration of this enzyme is an absolute requirement for its activity. At the core of the interaction between TryR subunits lays the dimerization interface, a hydrophobic patch that keeps both monomers tightly joined. Right in that hydrophobic patch we have identified a couple of amino acids that are important for maintaining a proper interaction between the monomers. These amino acids, glutamic acid 492 and glutamine 495, were incorporated into a 13-mer a-helix that we designed as an inhibitory peptide targeted to the dimerization interface of TryR. To assess this peptide and its follow-up derivatives, we implemented an easy scalable activity assay and developed a new ELISA that allowed us to quantify their impact on TryR dimerization and activity. The results obtained in this work allow us to conclude that TRL35 interacts with the Leishmania infantum TryR dimerization interface destabilizing its dimeric conformation and triggering the irreversible loss of activity because of enzyme precipitation.