Klonierung, Expression, Reinigung und Charakterisierung von 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenasen aus Arabidopsis thaliana (L.) HEYNHOLD

3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenasen (3β-HSD) können funktionelle 3β-Hydroxylgruppen von Steroiden zu 3-oxo-Gruppen dehydrogenieren oder, in entgegen gesetzter Reaktionsrichtung, 3-oxo-Gruppen reduzieren. In Prokaryonten sind sie am Steroidmetabolismus ‒ im Sinne einer Detoxifikation oder Assimilation ‒ beteiligt. 3β-HSDs der Säugetiere sind bifunktional; sie besitzen eine zusätzliche Δ5-Δ4-Ketosteroid-Isomerase-Aktivität (KSI) und spielen eine zentrale Rolle in der Biosynthese von Steroidhormonen. Über die Funktion von 3β-HSDs im Steroidmetabolismus im Pflanzenreich ist bisher wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden potentielle 3β-HSD-Kandidaten aus einer Arabidopsis thaliana cDNA-Bank aufgrund hoher Sequenzähnlichkeiten zu dem pflanzlichen Enzym Δ5-3β-HSD (EC 1.1.1.145) aus Digitalis lanata, welches innerhalb der Kardenolid-Biosynthese an der Pregnanbildung beteiligt ist, isoliert und heterolog exprimiert. Die attraktivsten Kandidaten ‒ als AtHSD1 (At2g47140) und AtHSD2 (At2g47130) bezeichnet ‒ wurden homogen gereinigt und kinetisch charakterisiert. Sie können der Familie der Short-chain Dehydrogenasen / Reduktasen (SDR) zugeordnet werden und besitzen eine breite Substratspezifität für 3β-Hydroxysteroide bzw. 3-Ketosteroide, die Variationen im Grundgerüst und in der Seitenkette zulässt. Es wurden C19-, C21-, C27-, C28- und C29- Steroide sowohl mit einer Δ5-Doppelbindung im Ring B als auch ohne eine solche dehydrogeniert und Δ5-, 5α- oder 5β-konfigurierte Ketosteroide reduziert. Für die AtHSD1 konnte eine KSI-Aktivität nachgewiesen werden. Im Gegensatz zum Enzym aus Digitalis bevorzugten die Enzyme aus Arabidopsis 5α-konfigurierte Steroide. Hypothetisch wurde eine Beteiligung innerhalb der Brassinosteroid-Biosynthese angenommen. Es konnte eine Umsetzung der Brassinosteroid-Vorläufer Campesterol und Cholesterol sowie dem Teasteron-Analogon 28-Homoteasteron festgestellt werden. T-DNA-Mutanten mit Insertionen in Bereich der Genloci der AtHSD1 und AtHSD2 zeigten teilweise einen wachstumsdefizienten Phänotyp mit einer verzögerten Keimung und Entwicklung. Aus den Beobachtungen wurde geschlussfolgert, dass sich die physiologische Funktion der AtHSD1 hauptsächlich auf die Wurzel beschränkt und die AtHSD2 eine größere Rolle für die Entwicklung der Gesamtpflanze spielt. Weiterführend sind quantitative und qualitative Analysen des endogenen Brassinosteroid-Gehaltes in den Mutanten notwendig, um die denkbare Funktion innerhalb der Brassinosteroid-Biosynthese zu belegen.