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[高分] 学位论文 PCV3 Cap蛋白单克隆抗体制备及间接ELISA检测方法的优化与评价
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| 其它 | 摘要：猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）作为近几年来新发现的一种猪源病毒,Cap蛋白是病毒唯一结构蛋白,也是首要免疫原性抗原。由于PCV3在猪群中流行广泛且目前尚无商品化疫苗,临床诊断主要依赖实验室检测方法,因此,获得稳定的特异性单克隆抗体并建立准确、灵敏的血清学检测方法,对于PCV3相关研究和感染的监测具有重要意义。 本研究以PCV3 Cap蛋白为研究对象,构建Cap蛋白的重组表达和纯化体系,制备与鉴定Cap蛋白的单克隆抗体,建立基于Cap蛋白的间接ELISA检测方法并对该方法进行优化与评价。首先构建pET-28a（+）-PCV3 Cap原核表达质粒,在大肠杆菌表达系统中诱导PCV3 Cap重组蛋白表达,通过Ni2+-NTA亲和层析进行纯化。SDS-PAGE结果表明,在IPTG浓度为1 mmol/L、30℃诱导6 h的条件下重组蛋白表达量最高,但主要以包涵体形式存在;Western blot结果表明,重组蛋白能够被His标签抗体及PCV3阳性血清特异性识别,说明该蛋白具有良好的免疫反应性。 其次,开展Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定,通过杂交瘤技术成功获得5株可稳定分泌抗PCV3 Cap蛋白的杂交瘤细胞株。亚型鉴定结果表明,1C1、2G8及2H10为IgG1型,8B5为IgG2b型,8A3为IgM型,轻链均为κ型。Western blot和间接ELISA检测结果表明,所制备的单克隆抗体能够特异性识别Cap蛋白,未见明显交叉反应,其中2H10株抗体在1:16000稀释条件下仍呈阳性反应,表明其在ELISA检测体系中的反应灵敏性较好;稳定性实验中,检测了经过冷冻与高温处理后4株单克隆抗体的活性,结果表明,3株IgG1亚型抗体稳定性较好,其中2H10稳定性保持在90%以上,稳定性及活性最佳。腹水效价结果表明:3株IgG1腹水抗体效价达1×10～5;腹水纯化结果表明:经Protein G纯化后,抗体纯度提高,浓度均高于2.9 mg/m L。 最后以纯化Cap蛋白作为包被抗原,采用棋盘滴定法优化间接ELISA反应条件,确定最佳反应条件为:抗原包被浓度100 ng/孔,5%脱脂奶粉封闭2 h;血清1:100稀释37℃孵育90 min;二抗1:5000稀释37℃孵育1 h,显色时间10 min。 |
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