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基于CRISPR/Cas9技术的草地贪夜蛾Ta n和Tdc基因的功能研究
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| 其它 | 摘要内容：草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda是近年入侵我国的重大害虫，已扩散至我国多个省市，危害性大。具有分布广泛、寄主植物种类多、暴食期破坏性强、繁殖迅速及防控难度大等特点，严重威胁着我国粮食产业。草地贪夜蛾高龄幼虫破坏性强，体色加深，打斗增强。从分子层面研究该虫的生物学特性可为探寻该虫的高效、绿色防控方法提供理论依据，也为今后使用遗传学手段防治该虫奠定基础。但是，通过RNA干扰研究该虫的基因功能，效率不高，因此，需要探究新的分子生物学方法。本研究构建了草地贪夜蛾CRISPR/Cas9基因编辑平台，利用该技术对参与体色调控基因Tan和章鱼胺和酪胺合成的关键基因酪氨酸脱羧酶（Tyrosinedecarboxylase，Tdc）进行了初步的功能探究，主要研究结果如下： 1、通过生物信息学分析，获得草地贪夜蛾Tan基因序列。实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式，发现sfTan在2龄草地贪夜蛾幼虫中表达量最高，在未性成熟雄虫（羽化1d）中表达量次高，除卵期无表达和蛹期低表达外，在其他发育阶段均广泛表达。在不同组织中，sfTan分别在幼虫的马氏管和成虫的复眼中表达量较高。利用CRISPR/Cas9系统敲除sfTan，获得sfTan基因缺失10bp的纯合突变体。跟野生型相比，发现突变型的高龄幼虫和预蛹腹节背面的毛瘤黑斑颜色变浅、形状变小，突变型蛹色变浅，突变型成虫翅边缘卷曲，翅面部分灰褐色消失，环形斑和顶角白斑消失。该结果表明CRISPR/Cas9系统能够有效地对草地贪夜蛾基因进行编辑。 2、章鱼胺和酪胺是昆虫重要的神经递质。我们的研究结果表明这两种生物胺参与草地贪夜蛾高龄幼虫之间的打斗。Tdc基因是合成这两种生物胺的关键酶。通过生物信息学分析，获得草地贪夜蛾Tdc基因序列。通过实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式，发现不同发育阶段中，sfTdc在卵期的表达量最高，在成虫期也有一定程度的表达。不同组织中，sfTdc仅在幼虫神经组织中有表达，在成虫触角中的表达量最高，在复眼和产卵器中也有一定程度的表达。通过CRISPR/Cas9敲除sfTdc，G0代突变型雌成虫与野生型雄虫交配成功后，产的卵块不孵化，大部分干瘪、变黑。因此，sfTdc基因可能调控草地贪夜蛾的生殖。 |
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