Desarrollo y caracterización de un conjugado del péptido análogo a glucagón (GLP-1) a nanopartículas de oro, como nueva forma de entrega de biomoléculas con potencial aplicación en diabetes

Generalmente el potencial terapéutico de péptidos y proteínas se ve dificultado por sus características físico-químicas, las cuales impiden su entrega de manera exitosa. En este sentido, la incretina GLP-1 es un péptido que posee gran utilidad terapéutica, debido a sus interesantes acciones sobre el metabolismo de la glucosa, por lo que actualmente es un excelente candidato para el tratamiento de la Diabetes Mellitus tipo 2. Sin embargo, como macromolécula de tipo peptídico, GLP-1 presenta una pobre permeabilidad a través del epitelio intestinal y es muy vulnerable a la degradación enzimática. Para superar estos inconvenientes se han realizado algunos esfuerzos para mejorar su eficacia terapéutica, desarrollando análogos metabólicamente estables, pero son muy pocos los estudios que se han enfocado en estudiar sistemas de entrega para prolongar su acción y mejorar su biodisponibilidad. En esta Tesis se presenta el estudio de un potencial sistema de entrega para biomacromoléculas, como GLP-1, basado en el uso de nanopartículas de oro (AuNP), con el propósito de mejorar su biodisponibilidad al favorecer su permeabilidad a través del epitelio intestinal, manteniendo su actividad biológica. Es así como se desarrolló un sistema de entrega a nanoescala, en el que análogos del péptido GLP-1 fueron conjugados a la superficie de AuNP. Para probar este concepto, se sintetizaron en fase sólida tres nuevos análogos del GLP-1, los cuales fueron caracterizados por cromatografía líquida y espectrometría de masas. Adicionalmente, a los péptidos se les evaluó su estructura secundaria por dicroísmo circular y su actividad insulinotrópica in vitro en la línea celular de páncreas Beta-TC-6. Posteriormente se prepararon y caracterizaron fisicoquímicamente los conjugados obtenidos; para ello se utilizaron técnicas de espectrofotometría UV-visible, microscopía electrónica de transmisión, potencial zeta y dispersión dinámica de la luz. Finalmente se evaluó la estabilidad de los conjugados, se estudió su permeabilidad intestinal, utilizando un sistema in vitro basado en un cocultivo de células de adenocarcinoma de colon humano y mucosecretoras (Caco-2/goblet), y además se determinó la actividad hipoglicemiante in vivo de uno de los péptidos y su respectivo conjugado a AuNP, después de una administración intraperitoneal en ratas. Los resultados obtenidos revelaron que los tres péptidos sintetizados: GLP-1 (7- 37)-Lys(Acet), GLP-1(7-37)-Lys(Cys) y GLP-1(7-37)-Lys(PegCys), tienen una conformación de tipo a hélice en disolución acuosa y presentan una actividad insulinotrópica similar a la de la incretina endógena GLP-1. Sin embargo, generan conjugados que difieren en estabilidad y capacidad de penetrar el epitelio intestinal, probablemente debido al tipo de interacción que generan con las AuNP. De esta forma, los conjugados de los péptidos que contienen cisteína (péptidos tiolados) resultaron ser más estables que el del péptido sin cisteína, frente al pH gástrico e intestinal, pues generan una interacción de tipo Au-S que le otorga una mayor estabilidad estérica al sistema coloidal. Por otra parte, el conjugado de AuNP al péptido GLP-1(7-37)-Lys(PegCys) fue el que penetró en mayor medida la monocapa de células, encontrándose aproximadamente un 0.016 % de oro después de 4 h de incubación, mientras que con los otros conjugados el nivel de oro no superó el 0.008 %. Además los péptidos y sus conjugados a AuNP no presentaron toxicidad en los sistemas celulares empleados (Beta-TC-6 y Caco-2/goblet, respectivamente). Finalmente, de la evaluación de la actividad hipoglicemiante in vivo se obtuvo que la eficacia hipoglicémica para el análogo GLP-1(7-37)-Lys(PegCys) y su conjugado a AuNP fue similar a la de la incretina endógena (18.7 ± 6.67 %, 27.6 ± 6.33 %y 22.1 ± 8.26 %, respectivamente), revelando que tanto la modificación realizada en el extremo C- terminal de GLP-1, como la presencia de la AuNP, no afectan su bioactividad. De esta forma, el sistema de entrega desarrollado en esta Tesis demostró penetrar las células intestinales en diferentes grados, y disminuir los niveles de glicemia in vivo de una manera similar al péptido endógeno después de su administración intraperitoenal, revelando que este tipo de sistemas es capaz de atravesar barreras biológicas y que la conjugación al nanomaterial no afecta la actividad de la biomolécula, por lo que podría convertirse en una estrategia para la entrega de biomacromoléculas con aplicación en diabetes.