米氏凯伦藻（福建株）毒性效应与毒理机制的研究

近几十年来，米氏凯伦藻藻华在我国近岸海域频频暴发，致使海水养殖生物，如鱼类与贝类大规模死亡，导致重大经济损失。其中， 2012 年福建省米氏凯伦藻藻华暴发，导致大量养殖贝类死亡，经济损失达 20.11 亿元，引起广泛关注。本实验室前期已经研究了该藻对受灾生物皱纹盘鲍的影响。但该藻藻华对海洋中其它生物的危害效应与原因目前并不清楚。本文选取了 2012 年福建省藻华区分离的一株米氏凯伦藻，在实验室条件下探究了该藻对几种典型海洋生物的危害效应与毒理机制，以求探讨福建省米氏凯伦藻藻华对海洋生态的影响与其原因。 本文首先探究了米氏凯伦藻对几种典型海洋生物，包括褶皱臂尾轮虫、卤虫和黑褐新糠虾幼虾，黄东海浮游动物关键种中华哲水蚤，养殖生物南美白对虾幼虾和大菱鲆幼鱼的急性毒性。结果显示，该藻在藻华密度下（ 3×104 cells/mL ）对所有实验生物的存活率都有着极显著的影响，实验进行 96 h 后，各实验生物死亡率分别为 100 、 23 、 20 、 97 、 33 、 53% ，其中轮虫对该藻最为敏感，在藻密度约 30 cells/mL 时 24 h 存活率为 57% 。米氏凯伦藻在溶解氧较高的情况下仍能导致实验生物死亡，而且非曝气条件能加剧该藻对大菱鲆的毒性效应。这说明米氏凯伦藻对海洋中不同营养级生物的存活都有着不利影响，而且这种影响来源于藻本身的毒性；在水体缺氧的条件下，米氏凯伦藻藻华可能会对生物产生更强烈的影响，从而破坏海洋生态环境，并严重威胁邻近海域的海水养殖业。 本文进一步探究了米氏凯伦藻对褶皱臂尾轮虫行为、结构和酶活性的影响。显微观察发现，受到该藻影响，轮虫立即出现了剧烈的回避反应，游泳能力逐渐减弱，并产生粘液，最终纤毛停止摆动，失去活性。结合扫描电镜的观察结果显示，在米氏凯伦藻影响下，轮虫身体结构短时间内出现明显的变化，个体逐渐失水皱缩，纤毛明显脱落，轮盘出现囊泡与溃烂的情况。这表明米氏凯伦藻能够显著影响轮虫的行为，并在短时间内破坏其身体结构。米氏凯伦藻在低密度下（ 30 、 30 、 300 、 1000 cells/mL ）就能够分别显著抑制轮虫酯酶（ Esterase ）、乙酰胆碱酯酶（ Acetylcholinesterase ）、总 ATP 酶活性与 Na+-K+-ATP 酶的活性 。这说明米氏凯伦藻低密度下就能够显著影响轮虫体内多种酶的活性，从而可能对其体内渗透调节、能量代谢与物质转运等过程产生不利影响。 为探究米氏凯伦藻的毒理机制，本文首先分析了米氏凯伦藻毒性的来源，探究了该藻不同组分对六种实验生物的毒性，同时利用隔离、冻干、重悬等手段进一步探究其对褶皱臂尾轮虫的毒性特性。结果显示，只有细胞重悬液对所有实验生物的存活有着显著影响，去藻过滤液与细胞破碎液对实验生物的存活都没有显著影响。利用3μm 滤 膜将藻细胞与轮虫隔离或是将藻细胞冻干后，该藻对轮虫存活并无显著影响。这表明米氏凯伦藻的毒性来自于存活的藻细胞，并与接触相关，其毒性物质可能附着在藻细胞膜上。离心重悬后米氏凯伦藻对轮虫毒性明显减弱，但会随时间逐渐恢复，这表明米氏凯伦藻毒性可能与藻细胞活性有关。 本文还验证了活性氧在米氏凯伦藻毒理机制中的作用，结果显示，米氏凯伦 藻中超氧阴离子（ ·O2- ）与过氧化氢（ H2O2 ）的含量分别为 0.014 ± 0.004 OD/(104 cells) 与 3.00 ± 0.00 nmol/(104 cells) ，但利用活性氧酶类将活性氧去除后，该藻对轮虫的毒性并没有显著变化。而且能显著影响轮虫存活的过氧化氢浓度是米氏凯伦藻含量的几十倍；受该藻影响的轮虫也没有表现出受到明显的氧化压力的情况。这说明活性氧并不是米氏凯伦藻导致轮虫死亡的主要原因。 本文同时探究了米氏凯伦藻脂溶性毒素对生物的影响效应，结果显示，该藻氯仿甲醇提取物在藻华浓度下对六种实验生物的存活都没有显著影响，这说明米氏凯伦藻脂溶性毒素可能并不能够直接对生物产生影响。不同介质与手段提取的物质对轮虫的毒性有着明显的差异，其中低温氮吹法（ 0 ℃ ）提取物的毒性明显高于悬蒸法提取物（ 30-60 ℃ ），这表明米氏凯伦藻毒性物质可能不耐高温，在提取过程中有所损耗。 以上实验结果表明，米氏凯伦藻能够显著抑制不同营养级生物，包括浮游生物与养殖生物的存活，这说明福建省米氏凯伦藻藻华能够对海洋生态系统产生不利影响，威胁当地海水养殖业的发展。这种影响来源与藻本身的毒性，并与存活的完整藻细胞相关。米氏凯伦藻还能够显著影响褶皱臂尾轮虫的行为与身体结构，并抑制轮虫体内多种酶的活性。米氏凯伦藻对轮虫的毒性与接触相关。藻细胞产生的活性氧与脂溶性毒素可能并不是米氏凯伦藻导致生物死亡的主要原因。