Adhesion and anti-inflammatory properties of enterococci from healthy human microbiota towards human colonic epithelial cells

Intestinal microbiota is composed of wide range of microbes colonizing colon walls and lumen.The metabolic potential of these microbes is vast and commensal or mutualist bacteria have numerous important functions towards host including production of extra nutrients, maintenance of immune homeostasis and protection against invading enteropathogens.Enterococcus spp.are common bacteria of intestinal microbiota of mammals and many other animals.These bacteria are widely considered as important health-promoting probiotics, while there are also infectious strains.Mucus-covered gut epithelial cell layer forms a barrier between body interior and the lumen of the gut.Gut epithelial cells communicate e.g. with cytokines, chemical communication molecules produced by many different cell types.IL-8 is a proinflammatory cytokine being released by gut epithelial cells for example under foreign enteropathogen invasion.In this study, seven strains of enterococci were examined in vitro with purpose to identify those being capable to attenuate inflammatory response (excretion IL-8) of gut epithelial cells towards LPS.Caco-2 and HT-29 cell lines are used in modelling gut epithelium in vitro.Adhesion properties of the different bacterial strains were investigated since adhesion to cell surfaces and mucus could be essential in mediating their influence on the cells nearby.All experiments were done with Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium isolates.Bacteria were cultivated in MRS and YCFA medium using agar plates, and broths cultures.Adhesion experiments towards mucus were done with bacteria from both cultivations.MRS cultivated strains were used in adhesion experiments with epithelial cell lines Caco-2 and HT-29.Enterococci were cultivated in anaerobic conditions.Caco-2 and HT-29 cells were cultured in oxic atmosphere supplemented with 5 % CO2.Adhesion experiments towards differentiating Caco-2 cells were done with 3-and 8-day old cultures, whereas adhesion towards undifferentiating HT-29 cells was experimented only with 8-day old cultures.In attenuation experiments the inflammatory response of HT-29 cells was induced using LPS from Escherichia coli.The quantity of IL-8 in the samples was measured using ELISA assay.The studied Enterococcus spp.strains (ETYCFA-9, -16, -23i, -23p, -24i, -25i, -25p) showed adhesiveness on mucus and both human epithelium cell lines.In mucus adhesion experiment the strains adhered strongly also to BSA which was used to block free adhesion sites of microtiter wells and therefore proved to be a poor blocking agent.Enterococci adhered well towards Caco-2 cells and adhesion was found more efficient towards cells in 8-day, than in 3day old cultures.Enterococcus adhesion was dependent on the absolute age of the cell lines as higher passage number resulted in weaker adhesion values.Results from the attenuation experiments were inconclusive as attenuation efficiency seems to depend on culture medium of bacteria.Throughout the experiments the most adherent strains were ETYCFA-9 and-24i and they showed better attenuation capacity when cultivated in YCFA than MRS medium, while other strains had greater attenuation efficiency when grown in MRS medium.Taken together, the results suggest that studied Enterococci might have strain and environment specific potential in attenuating LPS-induced IL-8 production in HT-29 cells.ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO Ympäristö-ja biotieteiden laitos, biologia VAINIO, UULA: Terveen ihmisen suolistosta eristettyjen enterokokkien tarttuminen ihmisen paksusuolen epiteeliin ja niiden tulehduksia ehkäisevät ominaisuudet kyseisissä epiteelisoluissa.Pro-gradu -tutkielma (40 op), 58 s., liitteitä 1 Lokakuu 2020 avainsanat: adheesio, anti-inflammatorisuus, Enterococcus, Caco-2, HT-29 TIIVISTELMÄ Ihmisen suoliston, erityisesti paksusuolen sisäpuolta kolonisoi suuri määrä erilaisia mikrobeja kolonisoi suolen sisäpuolta.Monet näistä mikrobeista ovat mutualistisia tai kommensaalisia ja niillä on lukuisia hyödyllisiä vaikutuksia isäntäeliöön, kuten lisäravintoaineiden tuottaminen, immuunijärjestelmän tasapainon ylläpitäminen sekä suolistopatogeeni-infektioiden ehkäiseminen.Suvun Enterococcus bakteerit ovat osana monien eläinten luonnollista suolistomikrobistoa.Nämä bakteerit mielletään usein terveyttä edistäviksi probiooteiksi, mutta enterokokkeihin kuuluu myös infektiovia, virulenttisia kantoja.Suolessa liman peittämä epiteelikudos muodostaa erottelevan rajapinnan kehon sisäosien ja suolen ontelon välille.Epiteelisolut kommunikoivat esimerkiksi sytokiinien avulla, mitkä ovat lukuisten solutyyppien erittämiä soluvälitteisiä viestimolekyylejä.IL-8 on tulehdusreaktiota indusoiva sytokiini, jota suolen epiteelisolut erittävät esimerkiksi suolistopatogeenien tunkeutuessa suolistoon.Tässä opinnäytetyössä tutkittiin seitsemää enterokokkikantaa in vitro ja pyrittiin tunnistamaan kannat, jotka kykenevät hillitsemään suolen epiteelisolujen LPS-indusoitua tulehdusvastetta (IL-8:n eritys).Koska bakteerien kiinnittyminen epiteelin läheisyyteen on olennaista pitkäaikaisen vaikutuksen aikaansaamiseksi, myös näiden enterokokkien tartuntakyky määritettiin suolen epiteelisoluihin sekä niitä ympäröivään limaan.Suoliston epiteeliä mallinnettiin Caco-2-ja HT-29-solulinjoilla.Kokeissa käytetyt kannat kuuluivat lajeihin Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium.Bakteereita kasvatettiin MRS-ja YCFA-kasvatusliuoksissa sekä vastaavilla agarmaljoilla.Kumpaakin kasvatusta käytettiin bakteerikantojen limaantarttumiskokeissa, kun taas Caco-2-ja HT-29-soluihin tarttumista tutkittiin vain MRS-kasvatetuilla kannoilla.Enterokokit kasvatettiin anaerobisissa oloissa, Caco-2-ja HT-29-solut puolestaan hapellisissa oloissa, joissa hiilidioksidipitoisuutta oli nostettu 5 %:iin.Erilaistuvia Caco-2-soluja käytettiin tarttumiskokeissa kolmen ja kahdeksan päivän ikäisinä viljelminä, kun taas erilaistumattomia HT-29-soluja vain kahdeksan päiväisinä.Tulehdusvasteen hillintäkokeissa HT-29-solujen tulehdusreaktiota indusoitiin Escherichia coli:n LPS:llä.Näytteiden IL-8 pitoisuus määritettiin ELISA-analyysillä.Tutkittavat Enterococcus -kannat (ETYCFA-9, -16, -23i, -23p, -24i, -25i, -25p) todettiin tartuntakykyisiksi limaan, sekä kumpaankin testatuista solulinjoista.Limaantarttumiskokeissa bakteerit tarttuivat myös voimakkaasti BSA:han, mitä käytettiin mikrotiitterilevyillä vapaiden tartuntakohtien tukkimiseen, osoittautuen huonoksi tarkoitukseensa.Enterokokit tarttuivat hyvin Caco-2-soluihin, tartuntatehokkuuden ollessa parempi kahdeksanpäiväisissä kuin kolmipäiväisissä viljelmissä.Solulinjan kasvatusikä ("passage" nro) vaikutti laskevasti tartuntakykyyn.Tulehdusvasteen hillintäkokeiden tulokset olivat keskenään ristiriitaisia, mutta viittasivat muutaman kannan mahdolliseen potentiaaliin hillitä LPS-indusoitua IL-8:n tuottoa HT-29-soluissa.Tulehduksen vaimentaminen todettiin riippuvaiseksi käytetystä bakteerien kasvatusliemestä.Kokeiden selkeästi tartuntakykyisimmät kannat olivat ETYCFA-9 ja -24i, mitkä hillitsivät tulehdusta parhaiten YCFA-kasvatettuina, muut MRS-kasvatettuina.