Rekombinante Herstellung und biophysikalische Charakterisierung von proBMP-2, BMP-2 und dem BMP-2-Propeptid

Bone morphogenetic proteins (BMPs) sind auto- und parakrin wirkende Cytokine, die in Vertebraten und Invertebraten an der Ausbildung von Körperachsen und Gliedmaßen während der Embryonalentwicklung beteiligt sind. In Vertebraten steuern sie zudem Knochenbildung, -umbau und -regeneration. Sie sind daher von großem medizinischem Interesse. So findet beispielsweise BMP-2 bereits Einsatz als Medikament bei der Behandlung schlecht heilender Schienbeinfrakturen. BMP-2 zählt zu den TGF-β-Familie von Cystin-Knoten-Proteinen und wird als Präproprotein synthetisiert, wobei das aminoterminale Propeptid mehr als doppelt so groß ist wie das eigentliche Cytokin. Trotz dieser Auffälligkeit sind bislang weder die Struktur noch die Funktion des BMP-2-Propeptids, ebensowenig wie die der Propeptide der anderen BMPs geklärt. In der vorliegenden Arbeit werden erstmals Verfahren für die rekombinante Herstellung eines proBMPs, sowie eines BMP-Propeptids vorgestellt, die die Gewinnung großer Mengen dieser Proteine durch Rückfaltung aus Inclusion Bodies ermöglichen. Dadurch werden künftige in-vivo- und in-vitro-Untersuchungen zu den Funktionen sowie Versuche zur Aufklärung der Struktur der BMP-Propeptide erleichtert. Die ursprüngliche Arbeitshypothese, daß sich durch Verwendung der Pro-Form bei die Renaturierung die Faltunsausbeute von BMP-2 erhöhen läßt, konnte unter den gewählten Bedingungen nicht bestätigt werden. Die Analysen der spektroskopischen Eigenschaften, sowie der thermodynamischen und kinetischen Stabilität der untersuchten BMP-2-Varianten ergaben jedoch Hinweise auf starke Wechselwirkungen zwischen der Propeptid- und der BMP-Domäne von proBMP-2, sowie auf Struktur- und Stabilitätsunterschiede zwischen freiem Propeptid und Propeptiddomäne. Die Eigenschaften des BMP-2-Propeptids ähneln diesbezüglich denen des Propeptids von TGF-β, was für die native Struktur des in vitro renaturierten Proteins spricht. Die spektroskopische Charakterisierung ergab zudem Hinweise auf eine Interaktion der Propeptiddomäne mit einer Rezeptorbindestelle der BMP-Domäne, sodaß auch eine Inhibitorfunktion ähnlich der des TGF-β-Propeptids denkbar ist.