Study of the molecular mechanisms in piRNA-mediated gene regulation

Από το CRISPR στους προκαρυώτες μέχρι και την παρεμβολή RNA (RNA interference, RNAi) στους ευκαρυώτες, μηχανισμοί που βασίζονται σε μικρά μόρια RNA, χρησιμοποιούνται εκτεταμένα για την άμυνα του ξενιστή ενάντια σε γονιδιωματικούς εισβολείς, όπως οι ιοί και τα μεταθετά στοιχεία (τρανσποζόνια). Τα τρανσποζόνια και οι ενδογενείς ρετροϊοί είναι αλληλουχίες γονιδιωματικού DNA, που έχουν τη δυνατότητα να μεταπηδούν σε διαφορετικές θέσεις μέσα στο γονιδίωμα (μετάθεση), προάγοντας έτσι τη μεταλλαξιγένεση και διακινδυνεύοντας τη σταθερότητα του γονιδιώματος. Στις γονάδες των ζώων, μία ειδική κατηγορία μικρών μορίων RNA, αλληλεπιδρούν με την PIWI υποοικογένεια των Αργοναυτών πρωτεϊνών (PIWI-interacting RNAs, piRNAs) και καθοδηγούν την καταστολή των μεταθετών στοιχείων σε μεταγραφικό και μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Από τα ασπόνδυλα στα θηλαστικά, το μονοπάτι piRNA είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη των γαμετικών κυττάρων και τη γονιμότητα. Κατά τη βιογένεση των piRNA μορίων, μεγάλοι γονιδιακοί τόποι (piRNA clusters) παράγουν μακριά μονόκλωνα πρόδρομα RNA, τα οποία διασπώνται σε χιλιάδες ξεχωριστές αλληλουχίες piRNA με μη προβλέψιμο τρόπο. Ως αποτέλεσμα, εκατομμύρια μοναδικά piRNA έχουν ανιχνευθεί στη φρουτόμυγα και στο ποντίκι. H αξιοσημείωτη αυτή ποικιλία σε συνδυασμό με την ανοχή για μη πλήρη συμπληρωματικότητα κατά την αναγνώριση του στόχου, δυσκολεύουν την κατανόηση μας γύρω από την εξειδίκευση της piRNA-διαμεσολαβούμενης γονιδιωματικής άμυνας για ξένα στοιχεία. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν οι μηχανισμοί της piRNA-διαμεσολαβούμενης μεταγραφικής αποσιώπησης χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό μοριακών, γενετικών και υπολογιστικών προσεγγίσεων. Σκοπός της μελέτης ήταν να κατανοήσουμε πώς ο ιδιαίτερα ετερόκλιτος πληθυσμός των piRNA αποφεύγει άστοχα συμβάντα που θα οδηγούσαν στη μόνιμη αποσιώπηση σημαντικών για τον ξενιστή γονιδίων. Για την επίτευξη του στόχου αυτού, αναπτύχθηκαν μία ποσοτική μέθοδος αλληλούχισης piRNA και ένα σύστημα άμεσης αναφοράς (direct reporter assay) για τη μέτρηση της piRNA-διαμεσολαβούμενης μεταγραφικής αποσιώπησης σε κυτταρικό επίπεδο. Η μελέτη ανέδειξε πως η ποσότητα των μεμονωμένων αλληλουχιών piRNA είναι εξαιρετικά δυσανάλογη και πως μόνο τα κορυφαία σε αφθονία piRNA είναι παρόντα σε κάθε κύτταρο. Παρατηρήθηκε ότι η αφθονία των μεμονωμένων piRNA ρυθμίζεται στο στάδιο της βιογένεσης και καθορίζεται από τις προτιμήσεις του ενζύμου Zucchini. Το σύστημα άμεσης αναφοράς υπέδειξε πως η αποτελεσματική αποσιώπηση ενός στόχου σχετίζεται με τον συνδυαστικό αριθμό συμπληρωματικών μορίων piRNA και επέτρεψε την ανίχνευση διαφορών στην piRNA-διαμεσολαβούμενη μεταγραφική αποσιώπηση από κύτταρο σε κύτταρο. Η πλειοψηφία των ετερόκλητων piRNA αλληλουχιών προκύπτει σποραδικά και οδηγεί σε κυτταρική ανομοιογένεια. Η βιογένεση αυτών των σπάνιων piRNA ενδεχομένως να υποδεικνύει την ύπαρξη ενός μηχανισμού που επιτρέπει την προσαρμογή σε νέους εισβολείς. Επιπλέον, προωθώντας την κυτταρική ανομοιογένεια, τα piRNAs θα μπορούσαν να προάγουν την αναπαραγωγική ποικιλομορφία και να αυξάνουν τις πιθανότητες επιβίωσης του είδους υπό εξελικτικές πιέσεις. Μία άμεση συνέπεια της παρούσας εργασίας είναι ότι η αφθονία των μεμονωμένων μορίων piRNA πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κατά τη μελέτη μηχανισμών που αφορούν τη λειτουργία, βιογένεση και στόχευση των piRNA. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης υπέδειξαν επίσης την αναγκαιότητα για υψηλής ποιότητας, ποσοτικά δεδομένα αλληλούχισης piRNA. Συνεπώς, στα πλαίσια αυτής της διατριβής αναπτύχθηκε επίσης μία απλοποιημένη και αξιόπιστη μέθοδος για την προετοιμασία υψηλής ποιότητας βιβλιοθηκών piRNA για αλληλούχιση νέας γενιάς. Η καινούρια αυτή μέθοδος εξάλειψε την απαίτηση για ραδιοσήμανση και απομόνωση του RNA υπό αποδιατακτικές συνθήκες εξασφαλίζοντας έτσι την αμερόληπτη πρόσβαση στον πλήρη πληθυσμό piRNA της Drosophila melanogaster. Η βελτιωμένη αυτή μέθοδος, επέτρεψε το χαρακτηρισμό των συμπλόκων Piwi-piRNA στις διαφορετικές κυτταρικές σειρές της ωοθήκης στην Drosophila έπειτα από διασταυρώσεις. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν πως η ίδια PIWI πρωτεΐνη ρυθμίζει ξεχωριστά μεταθετά στοιχεία στα κύτταρα της γαμετικής σειράς και στα ωοθυλακικά κύτταρα της ωοθήκης. Έπειτα από πρόσδεση ενός piRNA, η συγκεκριμένη PIWI πρωτεΐνη εισέρχεται στον πυρήνα όπου μεσολαβεί στην de novo επιγενετική αποσιώπηση των ενεργών μεταθετών στοιχείων. Στα ωοθυλακικά κύτταρα τα σύμπλοκα PIWI-piRNA στοχεύουν σχεδόν αποκλειστικά μία οικογένεια μεταθετών στοιχείων που ονομάζεται Gypsy. Αντιθέτως, τα αντίστοιχα σύμπλοκα στα κύτταρα της γαμετικής σειράς στοχεύουν ένα εύρος οικογενειών μεταθετών στοιχείων και ξεχωριστά μέλη της οικογένειας Gypsy. Τα αποτελέσματα αυτά συνδέονται με την διαφορική έκφραση των piRNA clusters που παρατηρήθηκε στους δύο κυτταρικούς τύπους της ωοθήκης. Πώς αυτή η διαφορική έκφραση των γονιδιακών τόπων που παράγουν piRNAs καθιερώνεται αρχικά και πώς ελέγχονται τα μεταθετά στοιχεία που παραβλέπονται από το μονοπάτι piRNA στις διαφορετικές κυτταρικές σειρές της ωοθήκης, είναι ερωτήματα που απαιτούν περαιτέρω μελέτη. Εν κατακλείδι, η παρούσα διδακτορική εργασία συμβάλει στην κατανόηση της piRNA-διαμεσολαβούμενης μεταγραφικής αποσιώπησης και παράλληλα δημιούργησε θεμέλια και μεθόδους για μελλοντικές piRNA μελέτες.