Improved Macrophage Isolation from Mouse Skeletal Muscle

Macrophages are a heterogeneous class of innate immune cells that offer a primary line of defense to the body by phagocytizing pathogens, digesting them, and presenting the antigens to T and B cells to initiate adaptive immunity. Through specialized pro-inflammatory or anti-inflammatory activities, macrophages also directly contribute to the clearance of infections and the repair of tissue injury. Macrophages are distributed throughout the body and largely carry out tissue-specific functions. In skeletal muscle, macrophages regulate tissue repair and regeneration; however, the characteristics of these macrophages are not yet fully understood, and their involvement in skeletal muscle aging remains to be elucidated. To investigate these functions, it is critical to be able to efficiently isolate macrophages from skeletal muscle with sufficient purity and yield for various downstream analyses. Here, we describe in detail an optimized method to isolate skeletal muscle macrophages from mice. This method has allowed the isolation of high-purity CD45+/CD11b+ macrophages from young and old mice, which can be further used for flow cytometry analysis, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and single-cell RNA sequencing., [摘要]巨噬细胞是异质类，提供防御的在主体上的主线路先天免疫细胞的通过phagocyt定义的病原体，消化荷兰国际集团它们，本荷兰国际集团的抗原的T和B细胞以引发适应性免疫。通过专门的促炎或抗炎活动，巨噬细胞也直接有助于清除感染和修复组织损伤。巨噬细胞分布在全身，并主要执行组织特定功能。在骨骼肌中，巨噬细胞调节组织的修复和再生。H 然而，这些巨噬细胞的特征还没有被完全理解，它们在骨骼肌衰老中的作用还有待阐明。为了研究这些功能，至关重要的是能够有效地从骨骼肌中分离出足够的纯度和产量的巨噬细胞用于各种下游分析。在这里，我们详细描述了一种从小鼠中分离骨骼肌巨噬细胞的优化方法。这种方法已允许的isolat的离子的高纯度CD45 + / CD11b的+从年轻和年老小鼠，其可以进一步用于流巨噬细胞cytometr ÿ分析，荧光激活细胞分选（FACS），和单细胞RNA测序。[背景] Metchnikoff及其同事在一个多世纪以前发现巨噬细胞为“专业”吞噬细胞（Underhill等，2016）。后来的研究表明，巨噬细胞构成一类异质的细胞，在整个人体的组织中发挥着不同的功能（Wynn等人，2013）。巨噬细胞可分为两种主要类型：组织驻留巨噬细胞和非组织驻留巨噬细胞（Ginhoux和Guilliams ，2016）。驻留在组织中的巨噬细胞可进一步分为两个不同的种群：胚胎衍生的自我更新和骨髓衍生的非自我更新巨噬细胞。衍生自典型自我更新的巨噬细胞的胚胎卵黄囊或胎肝包括小胶质细胞，肝巨噬细胞，肺泡巨噬细胞和朗格汉斯细胞。骨髓来源的非自我更新的常驻巨噬细胞必须通过循环特定组织水平的单核细胞来补充，包括肠道，胰腺和真皮中的常驻巨噬细胞（Chakarov等人，2019）。非驻留巨噬细胞衍生自骨髓祖细胞，并在受伤或感染后浸润组织（Kratofil等，2016）。巨噬细胞是高度通用的细胞即能够摄取和消化病原体以及坏死和感染细胞，ACTIVAT荷兰国际集团Ť和B淋巴细胞，和INDUC ING或抑制ING炎症（Shapouri-蒙哈达等人，2018） 。巨噬细胞的功能多样性由其动态极化能力很好地表示。根据局部环境的信号，巨噬细胞可以极化为功能相反的角色：促炎性M1或抗炎性M2亚型。Th1（T型辅助1型）淋巴细胞产生的细胞因子，包括干扰素γ（IFNγ或IFNG）和肿瘤坏死因子（TNF），使巨噬细胞极化为M1亚型，而Th2淋巴细胞产生的细胞因子，如白介素（IL）4和IL13促进巨噬细胞M2极化（Mills等，2000；Martinez等，2008 ）。极化的M1巨噬细胞部分地通过一氧化氮合酶（NOS）途径的上调诱导炎症，破坏病原体并清除细胞碎片（Rath等人，2014）。相比之下，M2巨噬细胞部分地通过精氨酸酶途径的上调来抑制炎症并促进组织修复（Rath等人，2014）。而M1和M2是公知的巨噬细胞的亚型，更近的单细胞研究已经在几种小鼠组织标识的附加亚型（Chakarov等人，2019 ; Jaitin 。等人，2019）。这些亚型与M1和M2具有相同点和不同点，这进一步揭示了巨噬细胞的异质性和多功能性。巨噬细胞适应个人组织和主要作用在一个相关的组织方式。来自不同组织的巨噬细胞具有独特的基因表达谱和转录调控途径（Gautier等，2012）。最近的研究表明，每个组织中的局部环境因素都有助于驻留巨噬细胞的组织特异性（Gosselin等，2014；Lavin等，2014）。例如，肿瘤生长因子β（TGFβ或TGFB）通过影响脑巨噬细胞的增强子/启动子景观来促进小胶质细胞的发育，而视黄酸决定腹膜巨噬细胞的特异性（Hoeksema and Glass ，2012）。这些研究进一步揭示了巨噬细胞适应局部环境并获得组织特异性身份的能力。作为哺乳动物中最大的器官，骨骼肌包含大量多样的常驻巨噬细胞。在骨骼肌中，巨噬细胞位于包膜和内膜（Cui et al。，2019）中，它们可以解决感染和修复损伤（Arnold et al。，2007; Tidball ，2011和2017）。例如，当骨骼肌受损时，来自血液的单核细胞分化并极化为促炎性M1巨噬细胞，从而消除病原体并清除组织碎片。随后，M1巨噬细胞与常驻M2巨噬细胞一起转化为M2巨噬细胞以抑制炎症并修复组织（Yang和Hu ，2018; Cui和Ferrucci ，2020 ）。近日，骨骼肌的巨噬细胞已经与生理适应性锻炼，年轻人和老年人之间的差异相关的个人（沃顿等人，2019;詹森等人，2020年），虽然在骨骼肌中的巨噬细胞亚型的全谱和其功能仅部分已知。我们最近发现，巨噬细胞存在于人类和小鼠骨骼肌是主要的的M2亚型（崔等人，2019）; ħ H但是，从骨骼肌和其它组织最近的单细胞分析表明，骨骼肌的巨噬细胞的身份是像LY更复杂（Chakarov等人，2019; Jaitin 。等人，2019;王等人，2020）。此外，骨骼肌巨噬细胞已被证明具有混合起源，包括胚胎卵黄囊，胎儿肝脏和成年骨髓（Wang等，2020）。目前还不清楚不同来源的巨噬细胞是否表现不同，和骨骼肌生理和老化每个巨噬细胞亚型的功能尚未被阐明。要回答这些问题，从骨骼肌中分离巨噬细胞至关重要。在最近的一份报告中，Liu及其同事建立了用于分离肌肉干细胞的协议，该协议也可以有效地从人骨骼肌中分离巨噬细胞（Liu等人，2015年; Kosmac等人，2018年）。在这里，我们报告的修改，以这种方法为isolat离子和PURIF ication的从老少小鼠骨骼肌居民的巨噬细胞，使该characteriz的通货膨胀由流动cytometr居民巨噬细胞Ÿ分析和单细胞转录组。