Development of radiolabeled bioorthogonal in vivo click agents for diagnostic pretargeting

Bioorthogonale Reaktionen ermöglichen die nukleare Bildgebung (SPECT & PET) von langsam akkumulierenden molekularen Sonden mit kurzlebigen Radionukliden. Diese hochselektiven und biokompatiblen 'Click'-Reaktionen erlauben die Knüpfung von kovalenten Bindungen im lebenden Organismus. Bei der bioorthogonalen Bildgebung wird im ersten Schritt ein mit einem bioorthogonalen Baustein modifizierter Marker (z.B. Antikörper) verabreicht, welcher sich im Zielgewebe anreichert. Nach erfolgter Akkumulation wird ein radioaktiv markiertes, niedermolekulares bioorthogonales 'Pull-Down'-Reagenz (PDR) verabreicht, welches sich mit rascher Pharmakokinetik homogen im Organismus verteilt und an den Marker im Zielgewebe bindet. Durch diesen zweistufigen Prozess können im Vergleich zum direkt markierten Antikörper bessere Kontraste und geringere Strahlendosen erzielt werden. Häufig angewandt wird die kupferfreie Click-Chemie zwischen Cyclooctinen und Aziden, wobei durch die im Cyclooctin vorhandene Ringspannung auf das katalytische (aber zelltoxische) Kupfer(I) verzichtet werden kann. Besonders aber im Bereich der Nuklearmedizin, wo nur äußerst geringe Substanzkonzentrationen vorliegen, hat sich die Diels-Alder Reaktion mit inversem Elektronenbedarf (IEDDA) zwischen 1,2,4,5-Tetrazinen und gespannten Alkenen (trans-Cycloocten, TCO) durch besonders hohe Geschwindigkeitskonstanten bewährt. Radiomarkierte 1,2,4,5-Tetrazine sind daher universelle Werkzeuge, welche die Bildgebung von unterschiedlichen TCO-modifizierten (Makro)molekülen mit hohem Kontrast ermöglichen. Zu Beginn der vorliegenden Dissertation (2013) waren nur wenige radiomarkierte Tetrazine bekannt. Diese Substanzen basierten zum überwiegenden Teil auf langlebigen Radiometallen, wobei durch den notwendigen Komplexbildner sehr polare und sperrige Moleküle entstanden. Der Einsatz von kovalent gebundenen, kurzlebigen Nukliden mit hoher Prinzip der bioorthogonalen Bildgebung spezifischer Aktivität (z.B.: Fluor-18) war jedoch durch Stabilitätsprobleme der 1,2,4,5- Tetrazine nicht möglich. In dieser Arbeit wird die Entwicklung von 11C und 18F markierten bioorthogonalen Sonden (Azide und 1,2,4,5-Tetrazine) für die zweistufige Positronen-Emissions-Tomographie beschrieben. Die Auswahl der Zielstrukturen erfolgte durch computergestützte Abschätzung der Reaktivität. Precursorsubstanzen für die nukleophile 18F-Fluorierung oder 11C-Methylierung wurden entwickelt, synthetisiert und charakterisiert. Nicht-radioaktive Referenzsubstanzen wurden zur Identifizierung der radiomarkierten Spezies, sowie zur Bestimmung der spezifischen Aktivität dargestellt. Zusätzlich wurden die Reaktionskinetiken der Tetrazin- Derivate mit dem Dienophil TCO mittels 'Stopped Flow' Messungen photometrisch bestimmt. Die Radiomarkierungs-Reaktionen wurden hinsichtlich Ausbeute und Reaktionsführung optimiert, und auf automatisierte Syntheseeinheiten übertragen, um die bioorthogonalen Sonden (PDRs) in hohen Aktivitäten zu erhalten. Die Fluor-18 markierten PDRs wurden hinsichtlich Identität, radiochemischer Reinheit, Reaktivität gegenüber TCO, sowie Stabilität in Blutplasma untersucht. Eine Auswahl der hergestellten radiomarkierten bioorthogonalen Sonden wurde im murinen Tiermodell untersucht. Hierbei wurde mittels Kleintier-PET/MR die Biodistribution und Pharmakokinetik, so wie durch Analyse von Blut-, Organ- und Harnproben der Metabolismus der jeweiligen Substanzen untersucht. PDRs mit günstigen Eigenschaften wie einer homogenen Biodistribution und hoher metabolischer Stabilität wurden in einfachen Modellen hinsichtlich ihrer in vivo Reaktivität untersucht, wobei z.B.: TCO-modifizierte Siliziumoxid-Nanopartikel in der Lunge mittels bioorthogonaler Kohlenstoff-11 PET sichtbar gemacht werden konnten.