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胃蛋白酶原Ⅰ（PGⅠ）单克隆抗体制备及其光电化学微流控免疫传感器检测方法研究
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| 其它 | 摘要：胃蛋白酶原Ⅰ（PGⅠ）是反映胃黏膜形态与生理功能的核心血清学标志物,在胃癌早期筛查、萎缩性胃炎诊断及病情监测中具有重要临床价值。传统PGⅠ检测方法（如酶联免疫吸附测定、化学发光免疫分析）虽已应用于临床,但存在检测成本高、仪器体积大、灵敏度与特异性难以提升等局限。而光电化学生物传感器兼具背景信号低、响应快速、易于微型化等优势,在肿瘤标志物检测领域展现出广阔前景。现有的PGⅠ的免疫学检测方法基于抗原抗体反应,而目前国内PGⅠ抗原抗体质量参差不齐,进口试剂价格居高不下,制约了精准检测技术的推广。基于此,本研究旨在制备高活性、高特异性的PGⅠ重组蛋白及单克隆抗体,并以此为试剂基础,构建基于SrTiO3/In2S3异质结材料的光电化学微流控免疫传感器,为PGⅠ的快速、灵敏、低成本检测提供新型技术手段。 本文研究内容如下: （1）PGⅠ重组蛋白的原核表达与鉴定 本文基于NCBI数据库PGⅠ基因CDS序列（NP＿055039.1）,在保持氨基酸序列不变的前提下进行密码子优化,合成目的基因并克隆至pET-32a（+）载体,构建pET-32a（+）-PGⅠ重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,并筛选诱导条件,在最优条件下实现PGⅠ高效表达。经Ni柱亲和层析纯化重组蛋白,采用SDS-PAGE、BCA法、Western blot及ELISA试验对其纯度、浓度、特异性及反应原性进行鉴定。 （2）PGⅠ单克隆抗体的制备与特性鉴定 以纯化的PGⅠ重组蛋白免疫BALB/c小鼠,待血清效价达标（>1:10000）后取脾细胞,采用PEG1500融合法与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合。经间接ELISA反复筛选与多次亚克隆,获得稳定分泌抗PGⅠ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并进行扩大培养。通过小鼠腹腔注射杂交瘤细胞以诱生腹水,经Protein A亲和层析纯化抗体,并对纯化后抗体进行亚型鉴定、浓度测定、效价检测及特异性分析。 |
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