RI-SEC-seq: Comprehensive Profiling of Nonvesicular Extracellular RNAs with Different Stabilities

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are considered the main vehicles transporting RNAs in extracellular samples, including human bodily fluids. However, a major proportion of extracellular RNAs (exRNAs) do not copurify with EVs and remain in ultracentrifugation supernatants of cell-conditioned medium or blood serum. We have observed that nonvesicular exRNA profiles are highly biased toward those RNAs with intrinsic resistance to extracellular ribonucleases. These highly resistant exRNAs are interesting from a biomarker point of view, but are not representative of the actual bulk of RNAs released to the extracellular space. In order to understand exRNA dynamics and capture both stable and unstable RNAs, we developed a method based on size-exclusion chromatography (SEC) fractionation of RNase inhibitor (RI)-treated cell-conditioned medium (RI-SEC-seq). This method has allowed us to identify and study extracellular ribosomes and tRNAs, and offers a dynamical view of the extracellular RNAome which can impact biomarker discovery in the near future.Graphical abstract:Overview of the RI-SEC-seq protocol: sequencing of size-exclusion chromatography fractions from nonvesicular extracellular samples treated or not with RNase inhibitors (+/- RI), [摘要]外来体和其他细胞外囊泡（EVs）被认为是在细胞外样品（包括人体液）中运输RNA的主要载体。但是，大部分细胞外RNA（exRNA ）不能与EV共纯化，而是保留在细胞条件培养基或血清的超速离心上清液中。我们已经观察到非囊泡的exRNA概况高度偏向那些对细胞外核糖核酸酶具有固有抗性的RNA。从生物标志物的角度来看，这些高度抗性的exRNA很有趣，但不能代表释放到细胞外空间的RNA的实际体积。为了了解exRNA动态并捕获稳定和不稳定的RNA，我们开发了一种基于大小排阻色谱（SEC）分馏的RNase抑制剂（RI）处理的细胞条件培养基（RI-SEC-seq）的方法。这种方法使我们能够鉴定和研究细胞外核糖体和tRNA，并提供了可以在不久的将来影响生物标志物发现的细胞外RNAome的动态视图。 图形概要：所述RI-SEC-SEQ协议的概述：大小排阻层析的级分的测序从nonvesicular胞样品用或不用RNA酶抑制剂（+/- RI）[背景]细胞外RNA（exRNA ）参与细胞间通讯，并且在微创液体活检中有望成为疾病的生物标志物（O'Brien et al。，2020）。为了在人体液中运输，exRNA需要获得一定程度的针对细胞外核糖核酸酶的保护，而细胞外核糖核酸酶在细胞外环境中无处不在。迄今为止，最受研究和最了解的机制是RNA封装在细胞外小泡（EVs）内，并将这些内源性脂质纳米颗粒释放到细胞外空间（Kalluri和LeBleu，2020年）。除了简单地保护exRNA免受降解外，EV还包含一系列与细胞摄取有关的表面蛋白（Hoshino等人，2015），作为在细胞之间转移RNA的媒介。这可以在生理上（Thomou等，2017）或在治疗性生物技术设置下（Kamerkar等，2017； Kojima等，2018）发生。与电动汽车无关的那些exRNA知之甚少（Li et al。，2018）。但是，早期工作表明，人血浆中的大多数microRNA正在与Argonaute 2形成可溶性核糖核蛋白复合物，并且不会在EV内运输（Arroyo等，2011； Turchinovich等，2011）。后来的工作表明，电动汽车的RNA含量没有以前建议的高（Chevillet等，2014），而且我们已经观察到细胞培养基中的大多数exRNA都保留在超速离心上清液中（Tosar等，2015）。我们惊讶地发现，我们可以在细胞条件培养基的超速离心上清液中测序的大多数小RNA是衍生自甘氨酸和谷氨酸异受体的5'tRNA一半（Tosar等人，2015）。这些序列在血浆，血清和其他生物流体中也是最丰富的（Srinivasan等人，2019），它们似乎也被转运到电动汽车之外（Dhahbi等人，2013）。我们随后观察到这些序列可以形成二聚体，并且这些二聚体对单链核糖核酸酶具有高度抗性（Tosar等人，2018）。这些观察结果表明，细胞外非囊泡RNA谱易于发生生存偏差（Tosar等人，2021），在这里我们倾向于仅观察到对降解更有抵抗力的RNA。尽管这对于生物标记物的研究可能是理想的，但在理解RNA释放机制方面可能会出现问题。因此，我们开发了一种方法来研究非囊泡的exRNA，无论其胞外稳定性如何。这种称为RI-SEC-seq的方法（用于：RNase抑制剂[RI]处理的细胞条件培养基的尺寸排阻色谱[SEC]分级分离）使我们能够研究RNA从细胞中有效释放的形式。按照该程序，我们发现了细胞外核糖体和tRNA的存在，以及细胞外tRNA衍生片段的细胞外生物发生（Tosar等人，2020）。后者由其他人使用不含RNase I的细胞系独立验证（Nechooshtan等，2020）。在这里，我们提供了实验步骤，以便读者还可以在低，中和高RNase活性下获得细胞外非囊泡RNAome的快照。这将有助于以全面，动态的方式表征exRNA谱，并鉴定具有生物标志物潜力的其他稳定RNA。